Summary
我们建议一个光学投影层析成像出生的规范化方法（BnOPT），占成像样品的吸收性能，以获得准确，定量荧光断层重建。我们利用该算法重建的荧光分子探针分布在小动物内脏。
Abstract
光学投影层析成像是一个三维成像技术，最近已作为主要在发育生物学和基因表达研究的成像工具推出。该技术首先脱水他们，然后放置在以2:1的比例（BABB或美利小号透明溶液）苯甲醇和苯甲酸苄酯的混合物呈现透明的生物样品。该技术由第一分级乙醇溶液脱水，然后把他们以2:1的比例（BABB或穆雷明显的解决方案），以清除苯甲醇和苯甲酸苄酯的混合物呈现的光学透明的生物样品。后结算过程中，可以大大降低样品中的散射贡献几乎可以忽略不计，而吸收的贡献不能完全消除。当试图重建正在调查样本内的荧光分布，影响重建，并导致这方面的贡献，无可避免的，图像失真和量化误差..虽然可以减少进一步的几周或几个月结算媒体的永久性吸收，这将导致荧光逐渐丧失和不切实际的长的样品处理时间。这才是真正的重建都外生造影剂（分子造影剂）以及内源性对比（如荧光蛋白基因表达的重组）。
Protocol
成像过程
实验装置是在图1中详细所示。 A光源LS供应照明和吸收测量荧光测量作为激发源，它是与窄带通过干扰滤波器BPF的过滤。一组固定和可变的结合自动快门的存在，小号可以控制光的样品量，并保持足够低，以防止任何漂白的中性密度过滤器ND。统一样本照明是通过使用一个扩束合并两个镜头伽利略望远镜和扩散。该样本是沉浸在结算解决方案，并在地方举行的持有人，并沿着它通过一个高速旋转舞台的绝对精度为0.05度（新港，PR50）的垂直轴旋转。三个不同的手动控制器允许的样品上予以倾斜和调整，在正交平面垂直轴。透信号是直接由CCD相机检测到荧光信号是通过一个狭窄的干扰，再加上一个长通滤波器（Omega.光学，伯瑞特波罗（Brattleboro），VT），然后与远心镜头TL收集带通滤波器的过滤。远心镜头提供的提供独特的功能，使他们理想的光学投影层析成像优势。事实上存在光圈停止位于镜头焦距的镜头组装范围内，保证了光线，使光圈的形象，将旅游平行于光轴，从根本上消除任何角度的失真，并提供相同的放大倍率多个平面内的远心深度。
样品制备
遵循下列程序是为了解决组织/器官
- 在煤灰样品固定为8个小时在4C。
- 样品在PBS洗涤15分钟
- 样品被嵌入在0.8％琼脂糖块
- 琼脂糖块是通过一系列的20％至100％的乙醇溶液脱水。这种脱水乙醇的一系列过程，有助于避免任何样品的不对称收缩。
- 最后的样品在100％的乙醇孵育10小时，以便消除任何从样品含水量。
- 样品清除所需的时间，把1:2的苯甲醇和苯甲酸苄酯的解决方案样品。请注意，时间可以有很大的不同，从样品到样品从几个小时到几天。
- 乙醇可在最短的痕迹目前在结算过程中引起断绝由于酒精内结算解决方案本身的热运动的重建项目结束。为了避免这个问题，在建议的第二个结算周期。
- 点4和5应该是在黑暗中进行，以避免任何漂白荧光造影剂或蛋白质。
心脏样品制备
重要的是要删除任何血液中的含量从之前的任何组织成像，以避免在重建的高吸收文物。可以遵循以下步骤。
- 与腹腔（IP）氯胺酮（90毫克/公斤）和甲苯噻嗪（10mg/kg的）的混合注射麻醉鼠标。
注：“从这个角度提出保持避光样本” - 注射肝素（IP）50 U和五分钟后，进行纵向的剖腹探查术。
- 打开左肾静脉（LRV）和下腔静脉注入盐水20毫升。
- 琼脂糖块应该有四个，一小时的孵化脱水，20％。 40％，60％，80％的乙醇，然后最后，样品在100％的乙醇孵育10小时（过夜）。
- 心脏固定后，一般的样品制备过程
注：“从这个角度提出保持避光样本”
吸收重建
在没有散射光吸收的重建一般类似于X - CT和可使用一个共同的过滤氡反投影算法。吸收图像，然后在透超过360沿垂直轴的1度角的预测，由CCD相机。很方便对齐像素的CCD列样品平行的垂直轴。
- 琼脂糖块放入充满结算解决方案的一腔
- 为激发和传输测量的准直光束照亮样本
- 旋转样品超过360个1度角的预测。
- 收购既吸收（内在）和荧光波长透图像。
- 放置一个快门，以避免连续照明和减少漂白。
- 使用AFiltered氡反投影算法tomographically重建样本
荧光重建
吸收重建所使用的算法不有效期为重建荧光分布，如果不考虑，吸收的贡献会导致严重的文物。
- 按照“Absoprtion重建”一节中表示。
- 同时收购的吸收光谱和荧光测量
- 组合成归出生的场图像数据
- 写下的内在价值和荧光波长的光传播的正向模型方程。
- 一个正向模型的格林函数的离散网格计算权重矩阵
- 反转的权重矩阵乘以检测归出生的场图像获得重建对象中的荧光分布
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
C. Vinegoni承认由美国国立卫生研究院（NIH）拨款1 RO1 - EB006432研究院的支持。
References
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-544 (2002).
- Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography. J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).
- Ntziachristos, V., Weissleder, R. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation. Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).
