Summary
Le sugerimos un enfoque normalizado para Nacido Tomografía de Proyección Óptica (BnOPT) que da cuenta de las propiedades de absorción de las muestras de imágenes para obtener reconstrucciones de fluorescencia precisa y cuantitativa tomográfica. Usamos el algoritmo propuesto para reconstruir la distribución de fluorescencia de la sonda molecular dentro de los órganos de pequeños animales.
Abstract
Tomografía por proyección óptica es una técnica de imagen tridimensional que se ha introducido recientemente como una herramienta de imagen sobre todo en la biología del desarrollo y estudios de expresión génica. La técnica hace que la muestra biológica ópticamente transparente, en primer lugar a la deshidratación y después colocar en una mezcla de alcohol bencílico y benzoato de bencilo en una proporción de 2:1 (Babb o Murray solución s abierto). La técnica hace que las muestras biológicas ópticamente transparente, en primer lugar a la deshidratación en soluciones de etanol clasificado luego colocarlos en una mezcla de alcohol bencílico y benzoato de bencilo en una proporción de 2:1 (Babb o solución clara Murray s) para borrar. Después de que el proceso de compensación de la contribución de la dispersión en la muestra se puede reducir considerablemente y de hecho casi insignificante, mientras que la contribución de la absorción no puede ser eliminada por completo. Al tratar de reconstruir la distribución de la fluorescencia en la muestra investigada, esta contribución afecta a las reconstrucciones y conduce, inevitablemente, a los artefactos de la imagen y los errores de cuantificación .. Mientras que la absorción podría reducirse aún más con una permanencia de varias semanas o meses en los medios de compensación, esto conducirá a una pérdida progresiva de la fluorescencia y un tiempo de procesamiento de la muestra exageradamente largo. Esto es cierto cuando la reconstrucción de los agentes de contraste exógenos (agentes de contraste molecular), así como el contraste endógenos (por ejemplo, la reconstrucción de la expresión genética proteínas fluorescentes).
Protocol
Procedimiento de imágenes
El montaje experimental se muestra en detalle en la figura 1. A LS fuente de luz sirve como luz para las mediciones de absorción y como fuente de excitación para medidas de fluorescencia y se filtra con una estrecha banda de interferencia de pase BPF filtro. Un conjunto de fijos y variables de densidad neutra ND filtros combinados con la presencia de un obturador automático S permiten controlar la cantidad de luz en la muestra y que lo mantenga lo suficientemente bajo como para evitar cualquier photobleaching. Iluminación uniforme de la muestra se logra mediante el uso de un expansor de haz SER con una combinación de dos lentes del telescopio de Galileo y un difusor. El S muestra se sumerge en la solución de compensación y se mantiene en su lugar en un titular y girar sobre su eje vertical por medio de una etapa de alta velocidad de rotación (Newport, PR50) con una precisión absoluta de 0,05 grados. Tres controladores manuales distintos para permitir que el eje vertical de la muestra que se inclina y se ajusta en su plano ortogonal. La señal de la transiluminación es detectado directamente por la cámara CCD, la señal de fluorescencia se filtra a través de un filtro de interferencias de banda estrecha de paso, junto con un filtro de paso largo (Omega. óptico, de Brattleboro, VT) y luego recogió con una lente telecéntrico TL. Objetivos telecéntricos ofrecen la ventaja de proporcionar características únicas que los hacen ideales para tomografía por proyección óptica. De hecho, la presencia de una abertura parada situada en el conjunto de la lente en el punto focal de la lente asegura que los rayos, que hacen que la imagen del diafragma de apertura, se desplazará en paralelo al eje óptico que elimina prácticamente cualquier distorsión de la perspectiva y ofrecer el mismo aumento de varios planos dentro de la profundidad telecéntrico.
Preparación de la muestra
El siguiente procedimiento con el fin de fijar los tejidos / órganos
- Muestras se han fijado en PFA durante 8 horas a 4 ° C.
- Muestra se lavó en PBS durante 15 minutos
- La muestra se inserta en un bloque de agarosa 0,8%
- Agarosa bloque se deshidrata a través de una serie de 20% a 100% de las soluciones de etanol. Este procedimiento de deshidratación de etanol serie ayuda a evitar cualquier contracción asimétrica de la muestra.
- Por último, la muestra se incuba 10 horas en etanol al 100% con el fin de eliminar cualquier contenido de agua de la muestra.
- Se coloca la muestra en una solución 1:2 de alcohol bencílico y benzoato de bencilo por el tiempo necesario para que la muestra clara. Tenga en cuenta que el tiempo puede variar considerablemente de una muestra a partir de unas pocas horas hasta varios días.
- De etanol en los rastros mínima puede estar presente al final del proceso de compensación que da lugar a separar los artefactos en las reconstrucciones debido a la agitación térmica del alcohol en la solución de limpieza en sí. Con el fin de evitar este problema, un ciclo de limpieza en segundo recomendado.
- Puntos 4 y 5 se debe realizar en la oscuridad para evitar el blanqueo de agentes de contraste fluorescente o las proteínas.
Corazón de preparación de la muestra
Es importante eliminar cualquier contenido de sangre de cualquier tejido antes de ser fotografiado con el fin de evitar artefactos de alta absorción en las reconstrucciones. El siguiente procedimiento se puede seguir.
- Anestesiar a los ratones con una vía intraperitoneal (IP) la inyección de una mezcla de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (10mg/kg).
Nota: ". De aquí en adelante mantener la muestra protegida de la luz" - Inyectar 50 U de heparina (IP) y cinco minutos más tarde, realizar una laparotomía longitudinal.
- Abrir la vena renal izquierda (VRI) e infundir 20 ml de solución salina en la vena cava inferior.
- El bloque de agarosa debe estar deshidratado, con cuatro, incubación de una hora, en el 20%. 40%, 60% y el 80% de etanol y, finalmente, las muestras se incuban en el 100% de etanol durante 10 horas (una noche).
- El corazón se fija el procedimiento de preparación de muestras en general
Nota: ". De aquí en adelante mantener la muestra protegida de la luz"
Reconstrucciones de absorción
Reconstrucción de la absorción óptica en la ausencia de dispersión son, en general, análoga a X-CT y se puede obtener mediante un algoritmo común retroproyección filtrada radón. Las imágenes de absorción son recogidas por una cámara CCD en la transiluminación más de 360 proyecciones con un ángulo de 1 grado a lo largo del eje vertical. Es conveniente para alinear el eje vertical de la paralela de la muestra a la columna de píxeles del CCD.
- Coloque el bloque de agarosa en una cámara llena con una solución de limpieza
- Iluminar la muestra con un haz colimado, tanto para la excitación y las mediciones de transmisión
- Rotar la muestra de más de 360 proyecciones con un ángulo de 1 grado.
- Adquirir imágenes en la transiluminación, tanto en la absorción (intrínseca) y longitudes de onda de fluorescencia.
- Coloque una velocidad de obturación para evitar la iluminación continua y reducir la decoloración.
- Utilice el bloqueo AFalgoritmo de retroproyección iltered radón para reconstruir tomográficamente la muestra
Reconstrucciones de fluorescencia
El algoritmo utilizado para la reconstrucción de absorción no es válida para la reconstrucción de la distribución de la fluorescencia y, si no se toma en cuenta la contribución de absorción de plomo a los artefactos graves.
- Proceder como se indica en el "Absoprtion Reconstrucciones" sección.
- Adquirir al mismo tiempo tanto la absorción y fluorescencia
- Combinar los datos en las imágenes de campo normalizado Nacido
- Escriba las ecuaciones del modelo de propagación de la luz hacia longitudes de onda intrínseca y de fluorescencia.
- Calcular el peso de la matriz en una malla de discretización de funciones de Green de la modelo hacia adelante
- Invertir la matriz de pesos y se multiplica por el detectado imágenes normalizado campo Nacido para obtener la reconstrucción de la distribución de la fluorescencia en el objeto
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
C. Vinegoni reconoce el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de subvención 1-SR1-EB006432.
References
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-544 (2002).
- Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography. J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).
- Ntziachristos, V., Weissleder, R. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation. Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).
