Summary
Nous suggérons une approche normalisée pour la tomographie Né projection optique (BnOPT) qui représente les propriétés d'absorption des échantillons imagés pour obtenir précises et quantitatives de fluorescence reconstructions tomographiques. Nous utilisons l'algorithme proposé de reconstruire la distribution de sonde fluorescence moléculaire au sein des organes d'animaux de petite taille.
Abstract
La tomographie optique de projection est une technique d'imagerie en trois dimensions qui a été récemment présenté comme un outil d'imagerie principalement dans la biologie du développement et les études d'expression génique. La technique rend échantillon biologique optiquement transparents en commençant par les déshydrater et en plaçant ensuite dans un mélange d'alcool benzylique et de benzoate de benzyle dans un rapport 2:1 (BABB ou Murray solution S Clair). La technique rend les échantillons biologiques optiquement transparents en commençant par les déshydratant dans des solutions d'éthanol à les placer ensuite dans un mélange d'alcool benzylique et de benzoate de benzyle dans un rapport 2:1 (ou une solution claire BABB Murray s) à effacer. Après le processus de compensation de la contribution de diffusion dans l'échantillon peut être considérablement réduit et a fait presque négligeable alors que la contribution d'absorption ne peut pas être complètement éliminés. En essayant de reconstruire la distribution de fluorescence dans l'échantillon de l'enquête, cette contribution affecte les reconstructions et conduit inévitablement à des artefacts d'image et des erreurs de quantification .. Alors que l'absorption pourrait être encore réduit avec une permanence de plusieurs semaines ou mois dans les médias de compensation, ce qui conduira à une perte progressive de la fluorescence et à un temps de traitement des échantillons anormalement long. Cela est vrai lorsque la reconstruction de deux agents de contraste exogènes (agents de contraste moléculaires) ainsi que le contraste endogène (par exemple des reconstitutions génétiquement exprimé protéines fluorescentes).
Protocol
Procédure d'imagerie
Le dispositif expérimental est présenté en détail dans la figure 1. Une source de lumière LS sert à la fois l'éclairage pour des mesures d'absorption et comme source d'excitation pour des mesures de fluorescence et elle est filtrée avec une bande étroite d'interférence filtre passe BPF. Un ensemble de filtres de densité fixe et variable ND neutre associé à la présence d'un obturateur automatique S permettent de contrôler la quantité de lumière sur l'échantillon et de le tenir assez bas pour éviter tout photoblanchiment. Un éclairage uniforme de l'échantillon est obtenue en utilisant un élargisseur de faisceau BE avec une lunette combiné deux verres de Galilée et un diffuseur. Le S échantillon est immergé dans la solution de compensation et est maintenu en place sur un support et tourné le long de son axe vertical au moyen d'une étape de vitesse de rotation élevée (Newport, PR50) avec une précision absolue de 0,05 degrés. Trois contrôleurs manuels distincts permettent de l'axe de l'échantillon verticale pour être incliné et ajusté dans son plan orthogonal. Le signal est directement détecté transillumination par la caméra CCD, le signal de fluorescence est filtré à travers un filtre interférentiel passe-bande étroite couplée à un filtre longpass (Omega. optique, Brattleboro, VT) et ensuite recueilli avec un TL télécentrique lentille. Objectifs télécentriques offrent l'avantage d'offrir des caractéristiques uniques qui les rendent idéales pour la tomographie optique de projection. En fait, la présence d'une ouverture d'arrêt situé à l'intérieur de l'Assemblée lentille au point focal de l'objectif assure que les rayons, qui font l'image de l'arrêt de l'ouverture, se rendra en parallèle à l'axe optique éliminant pratiquement toute distorsion de perspective et en fournissant le même grossissement des plans multiples dans la profondeur télécentrique.
Préparation des échantillons
La procédure suivante est suivie afin de fixer les tissus / organes
- Les échantillons sont fixés dans l'IFP pendant 8 heures à 4C.
- L'échantillon est ensuite lavé dans du PBS pendant 15 minutes
- L'échantillon est intégré dans un bloc de 0,8% Agarose
- Agarose bloc est déshydratée par une série de 20% à 100% de solutions d'éthanol. Cette procédure d'éthanol déshydratation séries aide à éviter tout retrait asymétrique de l'échantillon.
- Enfin, l'échantillon est incubé 10 heures dans de l'éthanol à 100% afin d'éliminer toute teneur en eau de l'échantillon.
- Mettre l'échantillon dans une solution 01:02 d'alcool benzylique et le benzoate de benzyle pour le temps nécessaire pour que l'échantillon clair. Notez que le temps peut varier considérablement d'un échantillon à partir de quelques heures à plusieurs jours.
- L'éthanol dans les traces minimes peuvent être présents à la fin du processus de compensation donnant lieu à rompre les artefacts dans les reconstructions dues aux mouvements thermiques de l'alcool dans la solution de compensation lui-même. Afin d'éviter ce problème, un cycle de compensation deuxième recommandée.
- Le point 4 et 5 doivent être effectuées dans l'obscurité pour éviter toute décoloration des agents de contraste fluorescents ou des protéines.
Préparation des échantillons Cœur
Il est important de supprimer tout contenu le sang de n'importe quel tissu avant d'être imagés afin d'éviter les artefacts forte absorption dans les reconstructions. La procédure suivante peut être suivie.
- Anesthésier la souris avec une voie intrapéritonéale (IP) par injection d'un mélange de kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (10mg/kg).
Note: ". Partir de ce moment garder l'échantillon abri de la lumière" - Injecter 50 U d'héparine (IP) et cinq minutes plus tard, réaliser une laparotomie longitudinale.
- Ouvrez la veine rénale gauche (LRV) et laisser infuser 20 ml de solution saline dans la VCI.
- Le bloc d'agarose doit être déshydraté, avec quatre, les incubations d'une heure, dans 20%. 40%, 60% et 80% d'éthanol, et puis finalement, les échantillons sont incubés dans de l'éthanol à 100% pendant 10 heures (une nuit).
- Cœur est alors fixée suivant la procédure générale de préparation d'échantillon
Note: ". Partir de ce moment garder l'échantillon abri de la lumière"
Reconstitutions d'absorption
Reconstruction de l'absorption optique en l'absence de diffusion sont en général analogues à X-CT et peut être obtenu en utilisant un algorithme de communes filtrée rétroprojection radon. Les images d'absorption sont alors prises par une caméra CCD de plus de 360 projections transillumination avec un angle de 1 degré sur l'axe vertical. Il est commode d'aligner l'axe vertical du parallèle échantillon sur la colonne de pixels du capteur CCD.
- Placez le bloc d'agarose dans une chambre remplie de solution de compensation
- Illuminer l'échantillon avec un faisceau collimaté à la fois pour l'excitation et des mesures de transmission
- Rotation de l'échantillon de plus de 360 projections avec un angle de 1 degré.
- Acquérir les images de la transillumination à la fois l'absorption (intrinsèque) et des longueurs d'onde de fluorescence.
- Placez un déclencheur pour éviter un éclairage continu et de réduire le blanchiment.
- Utilisez afiltered algorithme de rétroprojection au radon tomographie reconstruire l'échantillon
Reconstitutions de fluorescence
L'algorithme utilisé pour les reconstructions d'absorption n'est pas valable pour la reconstruction de la distribution de la fluorescence et, s'il n'est pas pris en compte, la contribution d'absorption conduira à des artefacts sévère.
- Procédez comme indiqué dans le "Absoprtion reconstructions" section.
- Acquérir simultanément l'absorption et des mesures de fluorescence
- Combinez les données dans le domaine des images normalisées Né
- Écrivez les équations du modèle avant de propagation de la lumière pour les longueurs d'onde intrinsèque et la fluorescence.
- Calculer la matrice de poids sur un maillage discrétisé des fonctions de Green du modèle vers l'avant
- Inverser la matrice de poids et de le multiplier par le détectés normalisé images de terrain Né pour obtenir la reconstruction de la distribution de fluorescence dans l'objet
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Acknowledgments
C. Vinegoni reconnaît le soutien de National Institutes of Health (NIH) accorder une-SR1-EB006432.
References
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