Summary
हम जन्मे ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी (BnOPT) के लिए सामान्यीकृत दृष्टिकोण है कि imaged नमूने के अवशोषण गुण के लिए खातों के लिए सटीक और मात्रात्मक प्रतिदीप्ति tomographic पुनर्निर्माण प्राप्त सुझाव देते हैं. हम प्रस्तावित एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के लिए छोटे जानवरों के अंगों के भीतर प्रतिदीप्ति आणविक जांच वितरण के पुनर्निर्माण.
Abstract
ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी एक तीन आयामी इमेजिंग तकनीक है कि हाल ही में विकासात्मक जीव विज्ञान और जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन में मुख्य रूप से एक इमेजिंग उपकरण के रूप में पेश किया गया है. तकनीक पहले उन्हें dehydrating और तब benzyl शराब का एक मिश्रण और एक 2:1 अनुपात (Babb या मूर्रे एस साफ समाधान) में लोबान बेंजोएट में रखकर द्वारा जैविक ऑप्टिकली पारदर्शी नमूना renders. तकनीक पहले उन्हें वर्गीकृत इथेनॉल समाधान में dehydrating तो उन्हें benzyl शराब और एक 2:1 अनुपात (Babb या मूर्रे साफ समाधान) स्पष्ट में लोबान बेंजोएट का एक मिश्रण में रखकर द्वारा जैविक नमूनों ऑप्टिकली पारदर्शी renders. समाशोधन प्रक्रिया के बाद नमूने में बिखरने योगदान बहुत हो सकता है और कम किया जा सकता लगभग नगण्य कर दिया जबकि अवशोषण योगदान पूरी तरह से समाप्त नहीं किया जा सकता है. जब जांच के तहत नमूना भीतर प्रतिदीप्ति वितरण के पुनर्निर्माण की कोशिश कर रहा, इस योगदान पुनर्निर्माण और सुराग को प्रभावित करता है, अनिवार्य रूप से छवि कलाकृतियों और मात्रा का ठहराव त्रुटियों के लिए .. जबकि अवशोषण समाशोधन मीडिया में सप्ताह या महीने के स्थायित्व के साथ आगे कम किया जा सकता है, यह प्रतिदीप्ति की प्रगतिशील हानि के लिए और एक unrealistically लंबे नमूना प्रसंस्करण समय के लिए नेतृत्व करेंगे. यह सच है जब दोनों exogenous विपरीत (आणविक विपरीत एजेंटों) एजेंट के रूप में अच्छी तरह के रूप में अंतर्जात विपरीत (आनुवंशिक रूप से व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन के पुनर्निर्माण जैसे) का पुनर्गठन.
Protocol
इमेजिंग प्रक्रिया
प्रयोगात्मक सेटअप चित्रा 1 में विस्तार में दिखाया गया है. एक प्रकाश स्रोत रास दोनों अवशोषण मापन के लिए रोशनी के रूप में और प्रतिदीप्ति माप के लिए उत्तेजना स्रोत के रूप में कार्य करता है और यह एक संकीर्ण बैंड से गुजारें हस्तक्षेप फिल्टर बीपीएफ के साथ फ़िल्टर्ड है. तय की और चर तटस्थ घनत्व फिल्टर एक स्वचालित शटर एस नमूना पर प्रकाश की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए और यह काफी कम करने के लिए किसी भी photobleaching को रोकने रखने के अनुमति की उपस्थिति के साथ संयुक्त एन डी का एक सेट. वर्दी नमूना रोशनी एक किरण विस्तारक एक संयुक्त दो लेंस गलीली दूरबीन और एक विसारक के साथ किया जाएगा का उपयोग करके हासिल की है. नमूना एस समाशोधन समाधान में डूब जाता है और जगह में है और एक उच्च गति रोटेशन चरण के 0.05 डिग्री के एक पूर्ण शुद्धता के साथ जिस तरह से (न्यूपोर्ट, PR50) द्वारा ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ धारक घुमाया पर आयोजित. तीन अलग पुस्तिका नियंत्रकों नमूना ऊर्ध्वाधर अक्ष के लिए झुका और अपनी orthogonal विमान में समायोजित किया जा अनुमति देते हैं. transillumination संकेत सीधे सीसीडी कैमरा के द्वारा पता लगाया है, प्रतिदीप्ति संकेत एक संकीर्ण बैंड से गुजारें हस्तक्षेप के साथ मिलकर एक longpass (Omega. ऑप्टिकल, Brattleboro, VT) फिल्टर और फिर एक telecentric लेंस TL के साथ एकत्र फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड है. Telecentric लेंस अद्वितीय विशेषताएं है कि उन्हें ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी के लिए आदर्श बना प्रदान करने का लाभ प्रदान करते हैं. वास्तव में एक छेद की उपस्थिति लेंस लेंस के फोकल बिंदु पर विधानसभा के भीतर स्थित रोक भरोसा दिलाते हैं कि रे, कि एपर्चर रोक की छवि बनाने, समानांतर ऑप्टिकल वस्तुतः किसी भी परिप्रेक्ष्य विरूपण को नष्ट करने और एक ही बढ़ाई प्रदान अक्ष के लिए यात्रा करेंगे telecentric गहराई के भीतर कई विमानों के लिए.
नमूना तैयार
निम्न कार्यविधि क्रम में ऊतक / अंगों को ठीक करने के लिए पीछा किया जाता है
- नमूने पीएफए में 4C कम 8 घंटे के लिए तय कर रहे हैं.
- नमूना तो 15 मिनट के लिए पीबीएस में धोया
- नमूना एक 0.8% agarose ब्लॉक में एम्बेडेड है
- Agarose ब्लॉक 20 से इथेनॉल समाधान के 100% की एक श्रृंखला के माध्यम से निर्जलित है. यह dehydrating इथेनॉल श्रृंखला प्रक्रिया नमूने के किसी भी असममित संकोचन से बचने में मदद करता है.
- अंत नमूना 100% इथेनॉल में 10 घंटे incubated है क्रम में करने के लिए नमूना से किसी भी पानी की सामग्री को निकालने के.
- लोबान शराब और लोबान Benzoate 01:02 समाधान में स्पष्ट नमूना के लिए आवश्यक समय के लिए नमूना रखो. ध्यान दें कि समय काफी कुछ ही घंटों से कई दिनों के लिए नमूना से नमूने के लिए भिन्न हो सकते हैं.
- न्यूनतम निशान में इथेनॉल समाशोधन समाशोधन समाधान के भीतर ही शराब के थर्मल गति की वजह से पुनर्निर्माण में कलाकृतियों को तोड़ वृद्धि देने की प्रक्रिया के अंत में उपस्थित किया जा सकता है. आदेश में इस समस्या से बचने के लिए, की सिफारिश में एक दूसरे समाशोधन चक्र.
- 4 प्वाइंट और 5 अंधेरे में प्रदर्शन किया जाना चाहिए किसी भी फ्लोरोसेंट विपरीत एजेंटों या प्रोटीन के विरंजन से बचने.
हार्ट नमूना तैयार
यह महत्वपूर्ण है पहले किसी भी ऊतक करने के क्रम में पुनर्निर्माण में उच्च अवशोषण कलाकृतियों से बचने के लिए imaged किया जा से किसी भी रक्त सामग्री को हटा दें. निम्न कार्यविधि का पालन किया जा सकता है है.
- Ketamine (90 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10mg/kg) के एक मिश्रण का एक intraperitoneally इंजेक्शन (आईपी) के साथ माउस anesthetize.
नोट: "इस बिंदु से आगे नमूना प्रकाश से सुरक्षित रखने" - हेपरिन (आईपी) के 50 यू इंजेक्षन और पांच मिनट बाद, एक अनुदैर्ध्य laparotomy प्रदर्शन.
- बाएँ गुर्दे शिरा (LRV) खोलें और IVC में नमकीन घोल के 20ml पानी में डालना.
- agarose ब्लॉक चार, एक घंटे incubations के साथ 20% में निर्जलित होना चाहिए. 40%, 60%, और 80% इथेनॉल, और फिर अंत में, नमूने 100% इथेनॉल में 10 घंटे (रात भर) के लिए incubated रहे हैं.
- दिल तो सामान्य नमूना तैयार करने की प्रक्रिया के बाद तय हो गई है
नोट: "इस बिंदु से आगे नमूना प्रकाश से सुरक्षित रखने"
अवशोषण पुनर्निर्माण
ऑप्टिकल अवशोषण के बिखरने के अभाव में पुनर्निर्माण सामान्य रूप में एक्स - सीटी के अनुरूप है और एक आम फ़िल्टर्ड राडोण backprojection एल्गोरिथ्म का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. अवशोषण छवियों तो transillumination में एक सीसीडी कैमरे द्वारा ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ एक 1 डिग्री के कोण के साथ 360 अनुमानों से अधिक ले लिया है. यह नमूना सीसीडी के पिक्सल के स्तंभ के लिए समानांतर के ऊर्ध्वाधर अक्ष संरेखित करने के लिए सुविधाजनक है.
- समाशोधन समाधान के साथ भरा कक्ष में agarose के ब्लॉक रखें
- दोनों उत्तेजना और संचरण मापन के लिए एक collimated किरण के साथ नमूना रोशन
- 1 डिग्री के कोण के साथ 360 अनुमानों से अधिक नमूना घुमाएँ.
- दोनों अवशोषण (आंतरिक) और प्रतिदीप्ति तरंगदैर्य पर transillumination में छवियों का मोल.
- एक शटर प्लेस सतत रोशनी से बचने के लिए और कम विरंजन.
- वायुसेना का प्रयोग करेंiltered राडोण backprojection एल्गोरिथ्म tomographically नमूना पुनर्निर्माण करने के लिए
प्रतिदीप्ति पुनर्निर्माण
अवशोषण के पुनर्निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता एल्गोरिथ्म प्रतिदीप्ति वितरण के पुनर्निर्माण के लिए वैध नहीं है और यदि खाते में नहीं लिया, अवशोषण योगदान गंभीर कलाकृतियों के लिए नेतृत्व करेंगे.
- आगे बढ़ें के रूप में "Absoprtion पुनर्निर्माण" अनुभाग में संकेत दिया.
- एक साथ दोनों अवशोषण और प्रतिदीप्ति माप मोल
- सामान्यीकृत जन्मे क्षेत्र छवियों में डेटा का मिश्रण
- आंतरिक और प्रतिदीप्ति तरंग दैर्ध्य के लिए प्रकाश के प्रचार के आगे मॉडल के समीकरण लिखें.
- आगे मॉडल के ग्रीन कार्यों के लिए एक discretized जाल पर वजन मैट्रिक्स की गणना
- वजन मैट्रिक्स उलटें और यह पता लगाया सामान्यीकृत जन्मे क्षेत्र छवियों से गुणा ऑब्जेक्ट में प्रतिदीप्ति वितरण के पुनर्निर्माण प्राप्त
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Acknowledgments
सी. Vinegoni स्वास्थ्य (NIH) 1-RO1 - EB006432 अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों से समर्थन मानता है.
References
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-544 (2002).
- Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography. J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).
- Ntziachristos, V., Weissleder, R. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation. Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).
