Summary
우리는 정확하고 양적 형광 단층 reconstructions를 얻기 위해 몇 군데 샘플의 흡수 특성에 대한 계정 광학 프로젝션 Tomography 위해 태어난 표준 접근 (BnOPT)를하는 것이 좋습니다. 우리는 작은 동물의 기관 내에있는 형광 분자 프로브 분포를 재구성하기 위해 제안된 알고리즘을 사용합니다.
Abstract
광학 프로젝션 tomography는 최근 주로 발달 생물학 및 유전자 발현 연구에 이미징 도구로 소개되어 3 차원 영상 기술입니다. 기술이 먼저 그들을 dehydrating 후 벤질 알코올 및 2시 1분 비율 (밥 또는 머리의 클리어 솔루션)의 벤질 벤조 산의 혼합물에 배치하여 광학 투명 생물 학적 샘플을 렌더링. 기술 먼저 다음 벤질 알코올 및 취소 2시 1분 비율 (밥 또는 머리의 클리어 솔루션)의 벤질 벤조 산의 혼합물에서 그들을 배치 등급 에탄올 솔루션에서 그들을 dehydrating하여 광학 투명 생물 학적 샘플을 렌더링. 흡수 기여 완전히 제거될 수 없다면서 삭제 처리 후 시료의 산란 공헌을 획기적으로 줄일 수와 거의 무시할 만들 수 있습니다. 조사 샘플 내에 형광 분포를 재구성하려고하면,이 기여 이미지 유물 및 부량 오류로 불가피하게, reconstructions 및 리드에 영향을 .. 흡수가 주 또는 지운 미디어 개월 영속성과 함께 추가로 줄일 수 있지만, 이것은 형광의 진보적인 손실과 unrealistically 긴 샘플 처리 시간으로 이어질 것입니다. 두 외인성 대비 요원 (분자 대비 대리인)뿐만 아니라 내생 대비 (유전자 표현 형광 단백질의 예 reconstructions)을 재구성하면 마찬가지입니다.
Protocol
이미징 절차
실험 설정은 그림 1에 자세히 표시됩니다. 광원 LS는 흡수 측정을위한 조명으로, 형광 측정 여기 소스로 모두 제공되며, 그것은 좁은 밴드 통과 필터 BPF와 간섭 필터입니다. S는 샘플에 빛의 양을 제어하고 photobleaching을 방지하기 위해 충분히 낮은 유지하도록 자동으로 셔터의 존재와 함께 고정 및 가변 중립 밀도 필터 ND의 설정하십시오. 통일 샘플 조명은 빔 확장기가 결합된이 렌즈 갈릴리 망원경과 디퓨저와 함께 사용하여 이루어진다. 예제 S는 비운의 솔루션에 포장되어 있으며, 0.05 도의 절대 정확도와 고속 회전 단계의 웨이 (뉴 포트, PR50)하여 수직 축을 따라 소유자 및 회전에 장소에서 개최됩니다. 세 개의 서로 다른 수동 컨트롤러는 직교 평면에 기울여서 조정해야 샘플 수직 축에 대한 수 있습니다. transillumination 신호 직접 CCD 카메라에 의해 감지되며 형광 신호는 다음 longpass 필터 (Omega. 광학, 브레 틀 보로, VT)과 telecentric 렌즈 TL과 수집과 함께 좁은 대역 통과 간섭 필터를 통해 필터링됩니다. Telecentric 렌즈는 광학 프로젝션 tomography에 이상적 만드는 독특한 기능을 제공하는 장점을 제공합니다. 사실 조리개의 존재는 렌즈의 초점에서 렌즈 어셈블리 내에있는 중지는 조리개 중지의 이미지를 만들 광선은, 거의 모든 관점 왜곡을 제거하고 같은 배율을 제공하는 광학 축에 평행 여행 것이라는 보장 telecentric 깊이 내에서 여러 대의 비행기.
샘플 준비
다음 절차는 조직 / 기관 문제를 해결하기 위해 다음이다
- 샘플은 4C 8 시간 PFA에서 수정되었습니다.
- 샘플은 다음 15 분 동안 PBS에 씻은입니다
- 샘플은 0.8 % 아가로 오스 블록에 포함된
- 아가로 오스 블록 에탄올 솔루션의 20 % ~ 100 %의 시리즈를 통해 탈수 있습니다. 이 dehydrating 에탄올 시리즈 절차는 샘플의 비대칭 수축을 피하는에 도움이됩니다.
- 마지막 예제는 샘플로부터 수분을 제거하기 위해 100 % 에탄올에 10 시간 incubated입니다.
- 취소한 샘플에 필요한 시간 벤질 알코올 및 벤질 벤조 산의 솔루션 1시 2분에 샘플을 넣어. 시간이 몇 시간에서 며칠이 샘플에서 샘플을 상당히 달라질 수 있습니다.
- 최소한의 흔적에 에탄올은 삭제 솔루션 자체 내에서 알코올의 열 운동에 의한 reconstructions의 유물을 도려 상승을주는 개간 과정의 끝에 존재하실 수 있습니다. 추천이 문제를 방지하기 위해, 두 번째 개간주기.
- 포인트 4와 5는 모든 형광등 대비 대리인 또는 단백질의 표백을 피하기 위해 어둠 속에서 수행되어야합니다.
심장 샘플 준비
reconstructions 높은 흡수 유물을 피하기 위해 몇 군데가 이전에 어떤 조직에서 어떤 혈액 콘텐츠를 제거하는 것이 중요합니다. 다음 절차는 다음 수 있습니다.
- 마취제 (90 MG / kg)과 xylazine (10mg/kg)의 혼합의 intraperitoneally (IP) 주입으로 마우스를 마취.
참고 : ".이 시점에서 앞으로 빛으로부터 보호 샘플을 유지" - 헤파린 (IP)의 50 U를 주사하고 5 분 후에, 세로 개복술을 수행합니다.
- 왼쪽 신장 정맥 (어브)를 열고 IVC에 생리 식염수 20ml의 달이다.
- 아가로 오스 블록은 20 %, 넷, 한 시간 incubations로 탈수한다. 다음 40 %, 60 % 및 80 % 에탄올, 그리고 결국, 샘플 10 시간 (야간)에 대한 100 % 에탄올에 incubated 수 있습니다.
- 심장은 다음 일반 샘플 준비 절차를 다음과 고정됩니다
참고 : ".이 시점에서 앞으로 빛으로부터 보호 샘플을 유지"
흡수 Reconstructions
산란의 부재에서 광 흡수의 재건 일반적으로 X - CT로 유사하며 일반적인 필터링 라돈의 backprojection 알고리즘을 사용하여 얻을 수있다. 흡수 이미지는 다음 세로 축을 따라 1도 각도 360 계획을 통해 transillumination에 CCD 카메라로 찍은 있습니다. 그것은 CCD의 픽셀의 열 샘플 병렬의 수직 축을 정렬하는 것이 편리합니다.
- 삭제 솔루션 가득한 챔버에 아가로 오스의 블록을 플레이스
- 여기 및 전송 측정 모두에 대해 collimated 빔을 시료를 조명
- 1도 각도 360 계획을 통해 샘플을 회전합니다.
- 모두 흡수 (내장) 및 형광 파장에 transillumination의 이미지를 획득.
- 지속적인 조명을 피하고 표백 줄이기 위해 셔터를 놓습니다.
- AF를 사용하여iltered 라돈의 backprojection 알고리즘은 tomographically 샘플을 재구 성할
형광 Reconstructions
흡수 reconstructions에 사용되는 알고리즘은 고려하지 않을 경우, 흡수 기여가 심각한 유물로 이어질 것이며, 형광 유통의 재건을 위해 유효하지 않습니다합니다.
- 로 "Absoprtion의 Reconstructions"섹션에 표시된 진행합니다.
- 동시에 흡수 및 형광 측정을 모두 취득
- 표준 출생 필드 이미지로 데이터를 결합
- 내장과 형광 파장에 대한 빛의 전파의 전달 모델의 방정식을 적어 두십시오.
- 앞으로 모델의 그린 기능 discretized 메쉬에 체중 매트릭스를 계산
- 체중 매트릭스를 반전하고 개체의 형광 유통의 재건을 얻기 위해 감지된 표준화 출생 현장 이미지에 의해 그것을 곱하면
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Acknowledgments
C. Vinegoni 건강 (NIH) 부여 1 RO1 - EB006432 국립 연구소의 지원을 인정한다.
References
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