Summary
Sugerimos uma abordagem Nascido normalizados para Tomografia projeção óptica (BnOPT), que representa as propriedades de absorção de amostras com imagens para obter resultados precisos e quantitativa de fluorescência reconstruções tomográficas. Usamos o algoritmo proposto para reconstruir a distribuição de sonda de fluorescência molecular dentro de órgãos de animais de pequeno porte.
Abstract
Tomografia projeção óptica é uma técnica de imagem tridimensional que foi recentemente introduzido como uma ferramenta de imagem principalmente em biologia do desenvolvimento e estudos de expressão gênica. A técnica torna amostra biológica opticamente transparentes pela primeira desidratando-los e depois colocar em uma mistura de álcool benzílico e benzoato de benzila na proporção de 2:1 (Babb ou Murray solução s aberto). A técnica torna amostras biológicas opticamente transparentes pela primeira desidratando-los em soluções de etanol graduada em seguida, colocando-os em uma mistura de álcool benzílico e benzoato de benzila na proporção de 2:1 (Babb ou solução Limpar Murray s) para limpar. Após o processo de compensação a contribuição de espalhamento na amostra pode ser muito reduzida e feitas quase insignificante enquanto a contribuição de absorção não pode ser eliminado completamente. Ao tentar reconstruir a distribuição de fluorescência da amostra sob investigação, esta contribuição afeta as reconstruções e leva, inevitavelmente, a artefatos de imagem e erros de quantificação .. Enquanto que a absorção pode ser reduzida ainda mais com uma permanência de semanas ou meses nos meios de compensação, isto levará a uma progressiva perda de fluorescência e de um tempo exageradamente longo amostra de processamento. Isto é verdade tanto para a reconstrução agentes de contraste exógeno (agentes de contraste molecular), bem como contraste endógeno (por exemplo, reconstruções de organismos geneticamente expressa proteínas fluorescentes).
Protocol
Procedimento de imagem
A configuração experimental é mostrado em detalhe na Figura 1. A LS fonte de luz serve tanto como iluminação para medições de absorção e como fonte de excitação para as medidas de fluorescência e é filtrada com uma estreita banda passante filtro de interferência de BPF. Um conjunto de fixos e variáveis neutra ND filtros de densidade combinada com a presença de um obturador automático S permite controlar a quantidade de luz na amostra e para mantê-la baixa o suficiente para evitar qualquer fotobranqueamento. Iluminação uniforme da amostra é conseguido usando um expansor de feixe BE com um combinado de duas lentes do telescópio de Galileu e um difusor. O S amostra é imersa na solução de compensação e é mantida no lugar de um titular e rodado ao longo de seu eixo vertical por meio de um estágio de alta velocidade de rotação (Newport, PR50) com uma precisão absoluta de 0,05 graus. Três controladores manuais permitem distintas para o eixo vertical para amostra ser inclinado e ajustado em seu plano ortogonal. O sinal de transiluminação é detectada diretamente pela câmera CCD, o sinal de fluorescência é filtrado por um filtro de interferência de banda estreita passagem junto com um filtro longpass (Omega. Optical, Brattleboro, VT) e, em seguida, coletados com uma lente telecêntrica TL. Telecêntrica oferecem a vantagem de fornecer características únicas que as tornam ideais para tomografia projeção óptica. Na verdade, a presença de uma abertura parar localizado dentro do conjunto de lentes no ponto focal da lente assegura que os raios, que tornam a imagem do diafragma de abertura, vai viajar paralelo ao eixo óptico praticamente eliminando qualquer distorção de perspectiva e proporcionando a mesma ampliação para múltiplos planos dentro da profundidade telecêntrica.
Preparação da Amostra
O procedimento a seguir é seguido a fim de fixar o tecido / órgãos
- Amostras são fixadas em PFA para 8 horas a 4C.
- Amostra é então lavadas em PBS por 15 minutos
- A amostra é incorporado em um bloco de Agarose 0,8%
- Agarose bloco é desidratado por uma série de 20% a 100% de soluções de etanol. Este procedimento série de desidratação de etanol ajuda a evitar qualquer retração assimétrica da amostra.
- Finalmente a amostra é incubada 10 horas em etanol 100%, a fim de remover qualquer conteúdo de água da amostra.
- Coloque a amostra em uma solução de 1:02 de álcool benzílico e benzoato de benzila, pelo tempo necessário para a amostra para limpar. Note que o tempo pode variar consideravelmente de amostra para amostra de algumas horas a vários dias.
- Etanol em traços mínimos podem estar presentes no final do processo de compensação que deu origem ao sever artefatos nas reconstruções devido ao movimento térmico do álcool na solução de limpeza em si. , A fim de evitar esse problema, um ciclo de desmatamento no segundo recomendado.
- Ponto 4 e 5 devem ser realizados no escuro para evitar o branqueamento de agentes de contraste fluorescente ou proteínas.
Preparação da Amostra coração
É importante remover qualquer conteúdo de sangue de qualquer tecido antes de ser trabalhada, a fim de evitar artefatos de alta absorção nas reconstruções. O seguinte procedimento pode ser seguido.
- Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal (IP) de uma mistura de cetamina (90 mg / kg) e xilazina (10mg/kg).
Nota: ". Deste ponto em diante manter a amostra protegida da luz" - Injetar 50 U de heparina (IP) e cinco minutos depois, realizar uma laparotomia longitudinal.
- Abra a veia renal esquerda (LRV) e infundir 20ml de solução salina para a VCI.
- O bloco de agarose deve ser desidratada, com quatro, incubações uma hora, em 20%. 40%, 60%, e etanol 80%, e, finalmente, as amostras são incubadas em etanol 100% por 10 horas (overnight).
- Coração é então fixado após o procedimento geral para preparação de amostras
Nota: ". Deste ponto em diante manter a amostra protegida da luz"
Reconstruções absorção
Reconstrução de absorção óptica na ausência de dispersão são, em geral, análogo ao X-CT e podem ser obtidas utilizando um algoritmo de retroprojeção filtrada comum Radon. As imagens são então levados a absorção por uma câmera CCD em transiluminação mais de 360 projeções com um ângulo de um grau ao longo do eixo vertical. É conveniente para alinhar o eixo vertical do paralelo de amostra para a coluna de pixels do CCD.
- Coloque o bloco de agarose em uma câmara preenchida com solução de limpeza
- Iluminam a amostra com um feixe colimado para ambos excitação e medições de transmissão
- Rode a amostra mais de 360 projeções com um ângulo de 1 grau.
- Adquirir imagens em transiluminação em ambas as absorção (intrínseco) e comprimentos de onda de fluorescência.
- Coloque um obturador para evitar a iluminação contínua e reduzir clareador.
- Use afalgoritmo de retroprojeção iltered Radon tomograficamente para reconstruir a amostra
Reconstruções de fluorescência
O algoritmo usado para as reconstruções de absorção não é válido para a reconstrução da distribuição de fluorescência e, se não levados em conta, a contribuição absorção levará a artefatos grave.
- Proceder como indicado no "Absoprtion Reconstruções" seção.
- Adquirir simultaneamente a absorção e medições de fluorescência
- Combine os dados no campo normalizado imagens Nascido
- Escrever as equações do modelo frente da propagação da luz nos comprimentos de onda intrínseca e de fluorescência.
- Calcular matriz de pesos em uma malha discretizada para funções de Green do modelo frente
- Inverter a matriz de pesos e multiplicá-lo pela detectado Normalized imagens campo Nascido para obter a reconstrução da distribuição de fluorescência no objeto
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Acknowledgments
C. Vinegoni reconhece o apoio do National Institutes of Health (NIH) conceder 1-RO1-EB006432.
References
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