Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Родился Нормализация для флуоресцентной оптической томографии для проекции изображений Всего Сердца

doi: 10.3791/1389 Published: June 2, 2009

Summary

Мы предлагаем Родился нормированный подход для оптической томографии Projection (BnOPT), который учитывает поглощения свойства отображаемого образцы для получения точных количественных и флуоресценции реконструкции томографических. Мы используем предложенный алгоритм для восстановления флуоресценции молекулярного зонда распределения в небольших органов животного.

Abstract

Оптическая томография проекции трехмерных изображений технику, которая была недавно представлена ​​как инструмент визуализации в первую очередь в биологии развития и исследования экспрессии генов. Техника оказывает биологический образец оптически прозрачным, сначала обезвоживания их, а затем размещения в смеси бензилового спирта и бензилбензоата в соотношении 2:1 (Бабб или Мюррей S Открытый раствора). Техника оказывает биологические образцы оптически прозрачным, сначала обезвоживания их в градуированный решения этанола затем поместив их в смесь бензилового спирта и бензилбензоата в соотношении 2:1 (Бабб или Очистить решение Мюррей ей) ясно. После расчистки процесс рассеяния вклад в образце может быть значительно сокращена и сделал практически не заметно в то время как поглощение вклад не может быть устранен полностью. При попытке восстановить флуоресценции распределение в исследуемый образец, этот вклад влияет реконструкции и приводит неизбежно к артефакты изображения и количественного ошибки .. Хотя поглощения может быть уменьшен с постоянство недель или месяцев на поляне СМИ, это приведет к прогрессирующей потере флуоресценции и нереально долго обработки образца. Это верно при реконструкции и экзогенных контрастных средств (молекулярных контрастных средств), а также эндогенные контрастность (например, реконструкция генетически выразил флуоресцентных белков).

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Процедура изображений

Схема экспериментальной установки показана на деталь на рисунке 1. LS источник света служит и в качестве подсветки для измерения поглощения, и как источник возбуждения для флуоресцентных измерений и фильтруется с узкой полосой пропускания интерференционного фильтра BPF. Набор постоянных и переменных фильтры нейтральной плотности ND в сочетании с наличием автоматического затвора S позволяют контролировать количество света на образце, и держать его достаточно низко, чтобы предотвратить любые фотообесцвечивания. Равномерное освещение образца достигается за счет использования расширителя пучка БЫТЬ с комбинированным две линзы телескопа Галилея и диффузор. Образец S погружается в раствор и очистка проводится на месте на держатель и вращать вокруг своей вертикальной оси в виде высокой стадии скорость вращения (Ньюпорт, PR50) с абсолютной точностью 0,05 градуса. Три различных контроллеров ручной позволяют образец вертикальной оси, чтобы быть наклонена, и скорректированной в ее ортогональной плоскости. Просвечивание сигнал непосредственно обнаружены ПЗС-камеры, сигнал флуоресценции фильтруется через узкие полосы пропускания интерференционного фильтра в сочетании с longpass фильтр (Omega. оптические, Brattleboro, VT), а затем собранные с телецентрической линз TL. Телецентрические линз предлагают преимущества в обеспечении уникальных особенностей, которые делают их идеальными для оптической томографии проекции. На самом деле наличие диафрагмы остановка расположена в объектив сборки в фокусе объектива гарантирует, что лучи, которые делают образ диафрагму остановить, будет путешествовать параллельно оптической оси практически не требует какой-либо искажения перспективы и предоставляя же увеличением для нескольких самолетов в телецентрической глубину.

Подготовка образцов

Следующая процедура для того, чтобы исправить тканей / органов

  1. Образцы закрепляются в PFA в течение 8 часов при 4С.
  2. Пример затем промывают в PBS в течение 15 минут
  3. Образец вложен в 0,8% агарозном блоке
  4. Агарозном блоке обезвоживается через ряд от 20% до 100% этанола решений. Это процедура обезвоживания этанола серии помогает избежать любых асимметричных усадки образца.
  5. Наконец образец инкубировали 10 часов в 100% этилового спирта для того, чтобы удалить все содержание воды из образца.
  6. Поместите образец в раствор 1:02 бензилового спирта и бензилбензоат течение времени, необходимого для образца, чтобы очистить. Обратите внимание, что время может значительно отличаться от образца к образцу от нескольких часов до нескольких дней.
  7. Этанол в минимальные следы могут присутствовать в конце процесса очистки порождая разорвать артефакты в реконструкции из-за теплового движения алкоголя в очистке самого решения. Для того, чтобы избежать этой проблемы, второй цикл очистки в рекомендуемых.
  8. Пункт 4 и 5 следует проводить в темноте, чтобы избежать любого отбеливания люминесцентных контрастных веществ или белки.

Подготовка Сердце Пример

Важно, чтобы удалить кровь контент из любой ткани, до включения в образ для того, чтобы избежать высоких артефактов поглощения в реконструкции. Следующая процедура может следовать.

  1. Обезболить мышь с внутрибрюшинно (IP) инъекции из смеси кетамина (90 мг / кг) и ксилазина (10mg/kg).
    Примечание: ". Начиная с этого момента держать образец защищенном от света месте"
  2. Inject 50 ЕД гепарина (IP) и через пять минут, выполнить продольной лапаротомии.
  3. Открытое левой почечной вены (LRV) и настаивать 20 мл физиологического раствора в IVC.
  4. Блок агарозы должна быть обезвоженной с четырьмя, один час инкубации, в 20%. 40%, 60% и 80% этанола, а затем, наконец, образцы инкубируют в 100%-ным этанолом в течение 10 часов (на ночь).
  5. Сердце затем фиксировали в общем порядке подготовки проб
    Примечание: ". Начиная с этого момента держать образец защищенном от света месте"

Поглощение Реконструкции

Реконструкция оптического поглощения в отсутствие рассеяния, в целом аналогичны X-CT и могут быть получены с использованием общей фильтруется алгоритм обратного проецирования Радона. Поглощения изображения затем приняты ПЗС-камеры в просвечивания более 360 проекций с 1 градусов по вертикальной оси. Это удобно для выравнивания вертикальной оси образца параллельно столбца пикселей ПЗС-матрицы.

  1. Место блок агарозы в камере, наполненной раствором очистки
  2. Illuminate образца с коллимированного пучка для возбуждения и передачи измерений
  3. Поворот образца более 360 проекций с 1 градусов.
  4. Получение изображений в просвечивание на обоих поглощения (внутренние) и флуоресценции длин волн.
  5. Место выдержки, чтобы избежать непрерывного освещения и снизить отбеливания.
  6. Используйте афiltered алгоритм обратного проецирования Радон к tomographically реконструировать образца

Флуоресценция Реконструкции

Алгоритм, используемый для поглощения реконструкций не распространяется на реконструкцию флуоресценции распределения и, если не учитывать, поглощение вклад будет привести к серьезным артефактам.

  1. Выполните указанные в "Absoprtion Реконструкция" разделе.
  2. Приобретать одновременно и поглощения и флуоресценции измерений
  3. Комбинат данные в нормированную Родился изображения области
  4. Запишите уравнения вперед модель распространения света для внутреннего и флуоресценции длин волн.
  5. Рассчитать вес матрицы на дискретизированным сетка для функций Грина вперед модель
  6. Обратить весовой матрицы и умножьте его на обнаруженный нормализованный Родился изображения поля для получения реконструкция флуоресценции распределение в объекте

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

С. Vinegoni признает поддержке Национального института здоровья (NIH) предоставлять 1-RO1-EB006432.

References

  1. Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-544 (2002).
  2. Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
  3. Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography. J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).
  4. Ntziachristos, V., Weissleder, R. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation. Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).
Родился Нормализация для флуоресцентной оптической томографии для проекции изображений Всего Сердца
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Vinegoni, C., Razansky, D., Figueiredo, J., Fexon, L., Pivovarov, M., Nahrendorf, M., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging. J. Vis. Exp. (28), e1389, doi:10.3791/1389 (2009).More

Vinegoni, C., Razansky, D., Figueiredo, J., Fexon, L., Pivovarov, M., Nahrendorf, M., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging. J. Vis. Exp. (28), e1389, doi:10.3791/1389 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter