Summary
Мы предлагаем Родился нормированный подход для оптической томографии Projection (BnOPT), который учитывает поглощения свойства отображаемого образцы для получения точных количественных и флуоресценции реконструкции томографических. Мы используем предложенный алгоритм для восстановления флуоресценции молекулярного зонда распределения в небольших органов животного.
Abstract
Оптическая томография проекции трехмерных изображений технику, которая была недавно представлена как инструмент визуализации в первую очередь в биологии развития и исследования экспрессии генов. Техника оказывает биологический образец оптически прозрачным, сначала обезвоживания их, а затем размещения в смеси бензилового спирта и бензилбензоата в соотношении 2:1 (Бабб или Мюррей S Открытый раствора). Техника оказывает биологические образцы оптически прозрачным, сначала обезвоживания их в градуированный решения этанола затем поместив их в смесь бензилового спирта и бензилбензоата в соотношении 2:1 (Бабб или Очистить решение Мюррей ей) ясно. После расчистки процесс рассеяния вклад в образце может быть значительно сокращена и сделал практически не заметно в то время как поглощение вклад не может быть устранен полностью. При попытке восстановить флуоресценции распределение в исследуемый образец, этот вклад влияет реконструкции и приводит неизбежно к артефакты изображения и количественного ошибки .. Хотя поглощения может быть уменьшен с постоянство недель или месяцев на поляне СМИ, это приведет к прогрессирующей потере флуоресценции и нереально долго обработки образца. Это верно при реконструкции и экзогенных контрастных средств (молекулярных контрастных средств), а также эндогенные контрастность (например, реконструкция генетически выразил флуоресцентных белков).
Protocol
Процедура изображений
Схема экспериментальной установки показана на деталь на рисунке 1. LS источник света служит и в качестве подсветки для измерения поглощения, и как источник возбуждения для флуоресцентных измерений и фильтруется с узкой полосой пропускания интерференционного фильтра BPF. Набор постоянных и переменных фильтры нейтральной плотности ND в сочетании с наличием автоматического затвора S позволяют контролировать количество света на образце, и держать его достаточно низко, чтобы предотвратить любые фотообесцвечивания. Равномерное освещение образца достигается за счет использования расширителя пучка БЫТЬ с комбинированным две линзы телескопа Галилея и диффузор. Образец S погружается в раствор и очистка проводится на месте на держатель и вращать вокруг своей вертикальной оси в виде высокой стадии скорость вращения (Ньюпорт, PR50) с абсолютной точностью 0,05 градуса. Три различных контроллеров ручной позволяют образец вертикальной оси, чтобы быть наклонена, и скорректированной в ее ортогональной плоскости. Просвечивание сигнал непосредственно обнаружены ПЗС-камеры, сигнал флуоресценции фильтруется через узкие полосы пропускания интерференционного фильтра в сочетании с longpass фильтр (Omega. оптические, Brattleboro, VT), а затем собранные с телецентрической линз TL. Телецентрические линз предлагают преимущества в обеспечении уникальных особенностей, которые делают их идеальными для оптической томографии проекции. На самом деле наличие диафрагмы остановка расположена в объектив сборки в фокусе объектива гарантирует, что лучи, которые делают образ диафрагму остановить, будет путешествовать параллельно оптической оси практически не требует какой-либо искажения перспективы и предоставляя же увеличением для нескольких самолетов в телецентрической глубину.
Подготовка образцов
Следующая процедура для того, чтобы исправить тканей / органов
- Образцы закрепляются в PFA в течение 8 часов при 4С.
- Пример затем промывают в PBS в течение 15 минут
- Образец вложен в 0,8% агарозном блоке
- Агарозном блоке обезвоживается через ряд от 20% до 100% этанола решений. Это процедура обезвоживания этанола серии помогает избежать любых асимметричных усадки образца.
- Наконец образец инкубировали 10 часов в 100% этилового спирта для того, чтобы удалить все содержание воды из образца.
- Поместите образец в раствор 1:02 бензилового спирта и бензилбензоат течение времени, необходимого для образца, чтобы очистить. Обратите внимание, что время может значительно отличаться от образца к образцу от нескольких часов до нескольких дней.
- Этанол в минимальные следы могут присутствовать в конце процесса очистки порождая разорвать артефакты в реконструкции из-за теплового движения алкоголя в очистке самого решения. Для того, чтобы избежать этой проблемы, второй цикл очистки в рекомендуемых.
- Пункт 4 и 5 следует проводить в темноте, чтобы избежать любого отбеливания люминесцентных контрастных веществ или белки.
Подготовка Сердце Пример
Важно, чтобы удалить кровь контент из любой ткани, до включения в образ для того, чтобы избежать высоких артефактов поглощения в реконструкции. Следующая процедура может следовать.
- Обезболить мышь с внутрибрюшинно (IP) инъекции из смеси кетамина (90 мг / кг) и ксилазина (10mg/kg).
Примечание: ". Начиная с этого момента держать образец защищенном от света месте" - Inject 50 ЕД гепарина (IP) и через пять минут, выполнить продольной лапаротомии.
- Открытое левой почечной вены (LRV) и настаивать 20 мл физиологического раствора в IVC.
- Блок агарозы должна быть обезвоженной с четырьмя, один час инкубации, в 20%. 40%, 60% и 80% этанола, а затем, наконец, образцы инкубируют в 100%-ным этанолом в течение 10 часов (на ночь).
- Сердце затем фиксировали в общем порядке подготовки проб
Примечание: ". Начиная с этого момента держать образец защищенном от света месте"
Поглощение Реконструкции
Реконструкция оптического поглощения в отсутствие рассеяния, в целом аналогичны X-CT и могут быть получены с использованием общей фильтруется алгоритм обратного проецирования Радона. Поглощения изображения затем приняты ПЗС-камеры в просвечивания более 360 проекций с 1 градусов по вертикальной оси. Это удобно для выравнивания вертикальной оси образца параллельно столбца пикселей ПЗС-матрицы.
- Место блок агарозы в камере, наполненной раствором очистки
- Illuminate образца с коллимированного пучка для возбуждения и передачи измерений
- Поворот образца более 360 проекций с 1 градусов.
- Получение изображений в просвечивание на обоих поглощения (внутренние) и флуоресценции длин волн.
- Место выдержки, чтобы избежать непрерывного освещения и снизить отбеливания.
- Используйте афiltered алгоритм обратного проецирования Радон к tomographically реконструировать образца
Флуоресценция Реконструкции
Алгоритм, используемый для поглощения реконструкций не распространяется на реконструкцию флуоресценции распределения и, если не учитывать, поглощение вклад будет привести к серьезным артефактам.
- Выполните указанные в "Absoprtion Реконструкция" разделе.
- Приобретать одновременно и поглощения и флуоресценции измерений
- Комбинат данные в нормированную Родился изображения области
- Запишите уравнения вперед модель распространения света для внутреннего и флуоресценции длин волн.
- Рассчитать вес матрицы на дискретизированным сетка для функций Грина вперед модель
- Обратить весовой матрицы и умножьте его на обнаруженный нормализованный Родился изображения поля для получения реконструкция флуоресценции распределение в объекте
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
С. Vinegoni признает поддержке Национального института здоровья (NIH) предоставлять 1-RO1-EB006432.
References
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-544 (2002).
- Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography. J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).
- Ntziachristos, V., Weissleder, R. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation. Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).