Summary
Vi föreslår ett Born normaliserad strategi för Optical Projection Tomography (BnOPT) som svarar för upptaget egenskaper avbildas prover för att få korrekt och kvantitativa fluorescens tomografisk rekonstruktioner. Vi använder den föreslagna algoritmen för att rekonstruera fluorescens molekylär sonden distribution inom litet djur organ.
Abstract
Optisk projektion tomografi är en tredimensionell bildteknik som nyligen har införts som en avbildning verktyg främst i utvecklingsbiologi och gen studier uttryck. Tekniken gör biologiska prov optiskt transparent genom att först torkning dem och sedan placera i en blandning av bensylalkohol och bensylbensoat i förhållandet 2:1 (Babb eller Murray s Klar lösning). Tekniken gör biologiska prover optiskt transparent genom att först torkningen dem i graderade etanol-lösningar sedan placera dem i en blandning av bensylalkohol och bensylbensoat i förhållandet 2:1 (Babb eller Murray s Klar lösning) för att rensa. Efter clearingen spridningen bidrag i provet kan minskas väsentligt och gjort nästan försumbara medan absorptionen bidrag inte kan elimineras helt. När jag försöker rekonstruera fluorescens fördelning i urvalet som undersöks, påverkar detta bidrag de rekonstruktioner och leder oundvikligen till bild artefakter och fel kvantifiering .. Medan absorptionen kan minskas ytterligare med en varaktighet veckor eller månader i clearingen media kommer detta att leda till gradvis förlust av fluorescens och en orealistiskt lång prov handläggningstiden. Detta gäller när rekonstruera både exogena kontrastmedel (molekylära kontrastmedel) samt endogena kontrast (t.ex. rekonstruktioner av genetiskt uttryckt fluorescerande proteiner).
Protocol
Imaging Förfarande
Den experimentuppställning visas i detalj i figur 1. En ljuskälla LS fungerar både som belysning för absorption mätningar och som exciteringskälla för fluorescens mätningar och det är filtreras med ett smalt band pass avstörningsfilter BPF. En uppsättning av fasta och rörliga neutrala täthetsfilter ND kombination med förekomsten av en automatisk slutare S gör det möjligt att styra mängden ljus på provet och att hålla den tillräckligt låg för att förhindra fotoblekning. Enhetliga prov belysning uppnås genom att använda en balk expander vara med en kombinerad två linser galileiska teleskop och en diffusor. Provet S är nedsänkt i clearing lösning och hålls på plats på en hållare och roteras längs sin vertikala axel med hjälp av en hög hastighet rotation skede (Newport, PR50) med en absolut noggrannhet på 0,05 grader. Tre distinkta manuella kontroller möjliggör för provet vertikala axeln att vinklas och justeras i dess ortogonala plan. Den genomlysning signalen direkt detekteras av CCD-kameran, fluorescens signalen filtreras genom ett smalt band-pass-interferens filtret i kombination med en longpass filter (Omega. Optisk, Brattleboro, VT) och sedan in med en telecentrisk lins TL. Telecentriska linser ger fördelen att den ger unika egenskaper som gör dem idealiska för optisk projektion tomografi. Faktum är att det finns en öppning stopp finns inom linsen Samling i fokus för objektivet försäkrar att strålar, som gör bilden av bländare sluta, kommer att resa parallellt med den optiska axeln praktiskt taget eliminerar alla perspektiv distorsion och ger samma förstoring för flera plan inom telecentrisk djup.
Provberedning
Följande procedur följs för att fastställa den vävnad / organ
- Prover har korrigerats i PFA i 8 timmar vid 4C.
- Provet leds sedan tvättas i PBS i 15 minuter
- Provet är inbäddad i en 0,8% agaros blocket
- Agarosen block är uttorkad genom en serie av 20% till 100% etanol lösningar. Denna torkning etanol serien förfarande hjälper till att undvika asymmetriska krympning av provet.
- Slutligen provet inkuberas 10 timmar i 100% etanol för att avlägsna eventuell vattenhalt från provet.
- Sätt provet i en lösning 01:02 av bensylalkohol och bensylbensoat för den tid som behövs för provet för att rensa. Observera att tiden kan variera kraftigt från prov till prov från några timmar till flera dagar.
- Etanol i minimala spår kan finnas i slutet av clearing-processen ger upphov till kapa artefakter i rekonstruktioner på grund av termisk rörelse av alkohol inom clearing lösningen själv. För att undvika detta problem, en andra clearing cykel i rekommenderas.
- Punkt 4 och 5 bör utföras i mörker för att undvika blekning av fluorescerande kontrastmedel eller proteiner.
Hjärta Provberedning
Det är viktigt att ta bort blod innehåll från alla vävnader före avbildas för att undvika hög absorption artefakter i rekonstruktioner. Följande procedur kan följas.
- Bedöva musen med ett intraperitonealt (IP) injektion av en mix av ketamin (90 mg / kg) och xylazin (10mg/kg).
Anm: ". Från denna punkt framåt hålla provet skyddas från ljus" - Injicera 50 U av heparin (IP) och fem minuter senare, utför en längsgående laparotomi.
- Öppna den vänstra nedsatt ven (LRV) och ingjuta 20ml saltlösning i IVC.
- Den agarosen blocket bör uttorkade med fyra, en timme inkubationer, i 20%. 40%, 60% och 80% etanol, och slutligen, är prov inkuberas i 100% etanol i 10 timmar (över natten).
- Heart är då fast efter det allmänna Provberedningsmetoden
Anm: ". Från denna punkt framåt hålla provet skyddas från ljus"
Absorption Rekonstruktioner
Rekonstruktion av optisk absorption i avsaknad av spridningen är i allmänhet jämförbar med X-CT och kan erhållas med hjälp av en gemensam filtrerad algoritm Radon återprojektion. Absorptionen bilderna sedan fattas av en CCD-kamera i genomlysning över 360 prognoser med en 1 graders vinkel längs den vertikala axeln. Det är bekvämt att justera den vertikala axeln av provet parallellt med kolumnen i pixlar CCD.
- Placera block av agarosen in i en kammare fylld med clearing-lösning
- Belysa provet med en kollimerad stråle för både excitation och mätningar transmission
- Rotera provet över 360 prognoser med en 1 graders vinkel.
- Förvärva bilder i genomlysning både absorption (inneboende) och fluorescens våglängder.
- Placera en slutartid för att undvika kontinuerlig belysning och minskar blekning.
- Använd AFiltered Radon återprojektion algoritm för att tomographically rekonstruera provet
Fluorescens Rekonstruktioner
Den algoritm som används för absorption rekonstruktionerna inte är giltig för återuppbyggnaden av fluorescens distribution och, om det inte beaktas, kommer absorptionen bidrag leda till allvarliga artefakter.
- Fortsätt enligt anvisningarna i "Absoprtion Rekonstruktioner"-avsnittet.
- Förvärva samtidigt både absorption och fluorescens mätningar
- Kombinera data i Born normaliserade fältet bilder
- Skriv ner ekvationer framåt modellen ljusutbredning för inneboende och fluorescens våglängder.
- Beräkna vikt matrisen på ett discretized mesh för Greens funktioner framåt modell
- Vänd vikt matris och multiplicera det med de upptäckta Född Normalized fältet bilderna för att få rekonstruktionen av fluorescens distribution i objektet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
C. Vinegoni erkänner stöd från National Institutes of Health (NIH) bevilja 1-RO1-EB006432.
References
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-544 (2002).
- Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography. J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).
- Ntziachristos, V., Weissleder, R. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation. Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).
