Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Tüm Kalp Görüntüleme Floresan Optik Projeksiyon Tomografi tarihi Normalizasyon

doi: 10.3791/1389 Published: June 2, 2009

Summary

Biz doğru ve kantitatif floresan tomografik rekonstrüksiyonlar elde etmek için görüntülü örneklerin emme özellikleri hesapları Optik Projeksiyon Tomografi için tarihi bir normalize yaklaşım (BnOPT) öneririm. Biz küçük hayvan organları içinde floresan moleküler prob dağılımını yeniden oluşturmak için önerilen bir algoritma kullanır.

Abstract

Optik projeksiyon tomografi, son zamanlarda gelişimsel biyoloji ve gen ekspresyon çalışmaları öncelikle bir görüntüleme aracı olarak ortaya konmuştur üç boyutlu bir görüntüleme tekniğidir. Ilk susuzlaştırma ve daha sonra bir 2:1 oranında (Babb veya Murray ler Temizle çözüm) benzil alkol ve benzil benzoat karışımı yerleştirme tekniği optik şeffaf biyolojik örnek vermektedir. Tekniği ilk temizlemek için 2:1 oranında (Babb veya Murray s sifresiz çözüm) benzil alkol ve benzil benzoat karışımı yerleştirerek kademeli etanol çözümler dehydrating optik şeffaf biyolojik örnekler vermektedir. Emilimini katkısı tamamen ortadan kaldırılamaz ise, temizleme işleminden sonra örnek saçılma katkısı büyük ölçüde azalır ve yok denecek kadar yapılmış olabilir. Soruşturma kapsamında numune içinde floresan dağılımını yeniden oluşturmak için çalışırken, bu katkının resim gölgeleri ve miktar hataları, kaçınılmaz olarak, rekonstrüksiyonları ve potansiyel etkiler .. Emilimi, hafta veya takas medya ay kalıcılığı daha da azaltılmış olabilir, bu floresan ilerici kaybı ve gerçek olamayacak kadar uzun bir örnek işlem süresi yol açacaktır. Hem de ekzojen kontrast ajanlar (moleküler kontrast ajanlar) gibi endojen kontrast (genetik olarak ifade floresan proteinleri örneğin rekonstrüksiyonlar) yeniden Bu doğrudur.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Görüntüleme Prosedürü

Deney düzeneği Şekil 1'de ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Bir ışık kaynağı LS emme ölçümleri için aydınlatma ve uyarma kaynağı olarak floresans ölçümleri için de hizmet vermekte ve dar bir bant geçiren girişim filtresi BPF, filtre edilir. S örnek ışık miktarını kontrol etmek ve herhangi bir photobleaching önlemek için yeterince düşük tutmak için izin veren bir otomatik deklanşöre varlığı ile birlikte sabit ve değişken nötral yoğunluk filtreleri ND kümesi. Tekdüzen örnek bir ışın genişletici bir kombine iki objektif Galile teleskop ve bir difüzör ile BE kullanarak aydınlatma elde edilir. Örnek G temizleme solüsyonu batırılır ve mutlak bir doğruluk ile 0,05 derece yüksek bir hızda dönme aşamasının yolu (Newport, Pr50) ile dikey eksen boyunca bir tutucu ve döndürülmüş yerinde tutulur. Üç ayrı manuel denetleyicileri ortogonal düzlemde eğik ve ayarlanabilir örnek dikey eksen için izin verir. Transillüminasyon sinyali doğrudan CCD kamera tarafından algılanır; floresan sinyal, daha sonra bir longpass filtresi (Omega. Optik, Brattleboro, VT) ve bir telesentrik lens TL ile toplanır ile birleştiğinde dar bir band-pass girişim filtresi süzülür. Telesantrik lensler, optik projeksiyon tomografi için ideal sağlayan benzersiz özellikler sağlayan bir avantaj sağlıyor. Aslında bir diyafram varlığı, lens montaj içinde lensin odak noktasında bulunan durdurmak diyafram durağı resim yapmak ışınları, neredeyse herhangi bir perspektiften bozulmasını ortadan kaldırarak ve aynı büyütme sağlayan optik eksene paralel gidecek olmasını sağlar telesentrik derinliği içinde birden fazla uçaklar için.

Numune Hazırlama

Doku / organlar düzeltmek için aşağıdaki yordamı takip

  1. Örnekleri 4C az 8 saat boyunca PFA sabitlenir.
  2. Örnek sonra 15 dakika PBS ile yıkandı
  3. Örnek,% 0.8 agaroz blok içinde gömülü
  4. Agaroz blok Etanol çözümler% 20 ila% 100 bir dizi susuz. Bu dehydrating etanol serisi prosedürü örnek herhangi bir asimetrik büzülme kaçınarak yardımcı olur.
  5. Son örnek, örnek herhangi bir su içeriği kaldırmak için% 100 etanol içinde 10 saat inkübe edilir.
  6. Benzil Alkol ve Benzil benzoat bir çözüm 01:02 temizlemek için örnek için gerekli olan süre için örnek koyun. Süresi birkaç saat ile birkaç gün numuneden diğerine önemli ölçüde değişebilir olduğunu unutmayın.
  7. Etanol minimal izleri temizleme çözümü kendi içinde alkol termal hareketi nedeniyle rekonstrüksiyonlarında eserler koparmaya yol açan temizleme sürecinin sonunda mevcut olabilir. Önerilen bu sorunu önlemek için, ikinci bir temizleme döngüsü.
  8. Nokta 4 ve 5, floresan kontrast ajanlar veya proteinlerin herhangi bir beyazlatma önlemek için karanlıkta yapılmalıdır.

Kalp Numune Hazırlama

Rekonstrüksiyonlarında yüksek emme eserler önlemek için görüntülü önce herhangi bir doku herhangi bir kan içeriği kaldırmak için önemlidir. Aşağıdaki yordam takip edilebilir.

  1. Ketamin (90 mg / kg) ve xylazine (10mg/kg) bir karışımı intraperitoneal (IP) enjeksiyonu ile fare anestezisi.
    Not: "Bu noktadan itibaren ileri ışıktan koruyarak örnek tutmak"
  2. 50 U heparin (IP) enjekte edilir ve beş dakika sonra, uzunlamasına bir laparotomi gerçekleştirmek.
  3. Sol renal ven (LRV) açın ve içine tuzlu IVC 20ml demlenmeye.
  4. Agaroz blok% 20, dört, bir saat inkubasyon ile kurutulmuş olmalıdır. Sonra% 40,% 60 ve% 80 etanol ve nihayet, numuneler 10 saat (gece) için% 100 etanol içinde inkübe edilir.
  5. Kalp ardından genel numune hazırlama prosedürü izleyerek sabit
    Not: "Bu noktadan itibaren ileri ışıktan koruyarak örnek tutmak"

Emilim rekonstrüksiyonlardır

Saçılma yokluğunda optik soğurma İmar genel olarak X-CT benzer ve ortak bir filtrelenmiş Radon geriçatma algoritması kullanılarak elde edilebilir. Emme görüntüler daha sonra dikey eksen boyunca 1 derecelik açı ile 360 ​​projeksiyonları üzerinde transillüminasyon bir CCD kamera ile alınır. CCD piksel sütun örnek paralel dikey eksen hizalamak için uygundur.

  1. Temizleme solüsyonu ile dolu bir odasına agaroz blok yerleştirin.
  2. Uyarma ve iletim ölçümleri her ikisi için de bir paralel ışın örnek aydınlatın
  3. 1 derecelik açı ile 360 ​​projeksiyonları üzerinde örnek döndürün.
  4. Hem emme (içsel) ve floresan dalga boylarında transillüminasyon görüntüleri edinin.
  5. Sürekli aydınlatma önlemek ve ağartma azaltmak için bir deklanşör yerleştirin.
  6. Af kullanın.iltered Radon geriçatma algoritması tomografik örnek yeniden

Floresan rekonstrüksiyonlardır

Emilimini rekonstrüksiyon için kullanılan algoritma dikkate alınmaması durumunda, emilimini katkısının ciddi eserler yol açacak, floresan dağılımı yeniden yapılanma için geçerli değildir ve.

  1. "Absoprtion rekonstrüksiyonlardır" bölümünde belirtildiği gibi devam edin.
  2. Aynı anda hem emme ve floresan ölçümleri Edinme
  3. Normalize tarihi alan görüntülere verileri birleştirip,
  4. Içsel ve floresan dalga boylarında ışık yayılma ileri model denklemleri yazınız.
  5. Green fonksiyonları için ileri modeli discretized örgü ağırlık matrisi hesaplayın
  6. Ağırlık matrisi ters çevirin ve nesne floresan dağılımı yeniden elde etmek için tespit Normalize tarihi alan görüntüler ile çarpın

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

C. Vinegoni Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe 1-RO1-EB006432 desteği kabul eder.

References

  1. Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-544 (2002).
  2. Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
  3. Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography. J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).
  4. Ntziachristos, V., Weissleder, R. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation. Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).
Tüm Kalp Görüntüleme Floresan Optik Projeksiyon Tomografi tarihi Normalizasyon
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Vinegoni, C., Razansky, D., Figueiredo, J., Fexon, L., Pivovarov, M., Nahrendorf, M., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging. J. Vis. Exp. (28), e1389, doi:10.3791/1389 (2009).More

Vinegoni, C., Razansky, D., Figueiredo, J., Fexon, L., Pivovarov, M., Nahrendorf, M., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging. J. Vis. Exp. (28), e1389, doi:10.3791/1389 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter