Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

Published: July 17, 2009 doi: 10.3791/1394

Summary

מדריך צעד אחר צעד כדי ליצור ממוקד עוברי דג הזברה chimeric על ידי השתלת בשלב blastula או gastrula.

Abstract

אחד הכלים החזקים ביותר בשימוש כדי לקבל תובנה תהליכים התפתחותיים מורכבים היא ניתוח של עוברים chimeric. הכימרה מוגדר אורגניזם המכיל תאים מבעל חיים אחד או יותר; פסיפסים הם סוג אחד של הכימרה, שבו תאים גנוטיפ יותר מעורבים, בדרך כלל wild-type ו מוטציה. בשנת דג הזברה, מפלצות יכול להתבצע בקלות על ידי השתלה של תאים מעובר לעובר התורם מארח בשלב העוברי המתאים. תאים התורם תווית מופקים על ידי הזרקת סמן השושלת, כגון פלורסנט לצבוע, לעובר אחד תא הבמה. תאים התורם תווית יוסרו מעוברים התורם הוכנס עוברים לארח ללא תווית באמצעות נפט שבשליטת פיפטה זכוכית רכוב על תרכובת מיקרוסקופ או לנתח. תאים התורם יכול במקרים מסוימים להיות ממוקד לאזור ספציפי או רקמות של העובר המתפתח blastula או gastrula מארח שלב על ידי בחירת האתר השתלת העובר מארח מבוסס על ומבוססת מפות גורל.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מדריך צעד אחר צעד כדי ליצור ממוקד עוברי דג הזברה chimeric על ידי השתלת בשלב blastula או gastrula.

אחד הכלים החזקים ביותר בשימוש כדי לקבל תובנה תהליכים התפתחותיים מורכבים היא ניתוח של עוברים chimeric. הכימרה מוגדר אורגניזם המכיל תאים מבעל חיים אחד או יותר; פסיפסים הם סוג אחד של הכימרה, שבו תאים גנוטיפ יותר מעורבים, בדרך כלל wild-type ו מוטציה. בשנת דג הזברה, מפלצות יכול להתבצע בקלות על ידי השתלה של תאים מעובר לעובר התורם מארח בשלב העוברי המתאים. תאים התורם תווית מופקים על ידי הזרקת סמן השושלת, כגון פלורסנט לצבוע, לעובר אחד תא הבמה. תאים התורם תווית יוסרו מעוברים התורם הוכנס עוברים לארח ללא תווית באמצעות נפט שבשליטת פיפטה זכוכית רכוב על תרכובת מיקרוסקופ או לנתח. תאים התורם יכול במקרים מסוימים להיות ממוקד לאזור ספציפי או רקמות של העובר המתפתח blastula או gastrula מארח שלב על ידי בחירת האתר השתלת העובר מארח מבוסס על ומבוססת מפות גורל.

חלק 1: הזרקת עוברים דג הזברה בשלב 1-התא.

  1. Dechorionation אנזימתי של 1 תאים העוברים שלב.

    כדי עוברי dechorionate proteolytically, דגירה בשלב 1 תאים עבור ~ 1-5 "בפתרון מ"ג / מ"ל ​​0.5 pronase כמתואר בספר דג הזברה 1. Moniter dechorionation מקרוב לצלול עוברים בינונית העובר (EM) עם פן / סטרפטוקוקוס 1 בהקדם chorions מתחילים בבירור קריסה. שוחרר לאחר מן chorions שלהם, עוברים שלב blastula ו gastrula הם שבירים ידבק פלסטיק או להתפורר אם חשוף לאוויר. לכן לשמור עוברים dechorionated שקוע פן / סטרפטוקוקוס EM, העברה בין המנות באמצעות אש מלוטש רחב נשא pipet זכוכית, ולשמור באחת אגר מצופה צלחות פלסטיק (1.2% ב agarose פן / סטרפטוקוקוס EM) או autoclaved זכוכית בצלחות פטרי.
  2. הזרקת dechorionated עוברים עם סמן השושלת.

    הכינו צלחת הזרקת ידי הוספת שקופיות הזכוכית בזווית של 45 מעלות לרוחב החלק הרחב ביותר של צלחת פטרי שלושה רבעים מלא של 1.2% agarose שנעשו פן / סטרפטוקוקוס EM. הסרה של השקופית לאחר מיצוק agarose משאיר שוקת משופעים. העברת עוברים dechorionated לתוך השוקת של צלחת זריקה מלא פן / סטרפטוקוקוס EM. הזרק כרכים 1nl של סמן השושלת באמצעות מכויל בדיוק האש משך הזרקה זכוכית פיפטה ו הזרקה בלחץ מעטה, כפי שמתואר בספר דג הזברה 1. הזרק צבעים נמוך משקל מולקולרי קליעים נותבים השושלת ישירות לתוך החלמון של עוברים dechorionated בין 1 ו - 4 תאים בשלבים. פתרון 3% פלורסנט dextran מספיק כדי לאפשר זיהוי של תורם התאים שמקורם בעוברים chimeric באמצעות מספר ימים של התפתחות. כאשר סמן השושלת הוא mRNA קידוד חלבון פלואורסצנטי (עבור, למשל GFP או RFP), להזריק ישירות לתוך תא של העובר המוקדם 1-תא הבמה.
  3. הזרקת הלא dechorionated עוברים עם סמן השושלת.

    הכן רב גם מנות הזרקה באמצעות גיבוש 1.2% agarose ב EM סביב עובש עם בארות בערך באותו רוחב כמו קוטר סיסית. העברה ללא dechorionated עוברים לתוך צלחת רב גם זריקת חצי מלא פן / סטרפטוקוקוס EM. הסר את הנוזלים העודפים. משותקת לכן, ניתן להזריק עוברים עם סמן כרכים 1nl של השושלת כפי שתואר לעיל.
  4. העלאת עוברים מוזרק להשתלה.

    הרם עוברים בצפיפות נמוכה (40-50 עוברים לכל צלחת) ב פן טרי / סטרפטוקוקוס EM. שלב התאמה התורם ולארח עוברי משמש להשתלה די מקרוב. עבור המגן השתלות הבמה, לשאוף מעט תורמים כדי לפגר המארחים; לב עוברי מוזרק נוטים להתעכב מעט. דגירה עוברים בטמפרטורות שונות, 25 ° C, 28 ° C, 31 ° C, כדי להתנודד הפיתוח שלהם ולהגדיל את חלון הזמן שעליו ניתן לבצע השתלות.

חלק 2: ביצוע עוברי דג הזברה chimeric על ידי השתלה.

  1. השתלת בשלבים blastula על stereomicroscope
  1. תיאור לבוש ההשתלה עבור blastula

    המנגנון המשמש השתלת תאים של blastula דג הזברה מכיל כונן שבשליטת מיקרומטר מזרק המילטון (10 l-50 l) מצורף על ידי שסתום משולשת למאגר של שמן מינרלי לבעל micropipette דרך באורך של צינורות גמישים . לאחר הרכבת את מעטה השתלה, הוא מלא שמן מינרלי, דואג לחסל את כל בועות אוויר מהמערכת. נוכחות של בועת אוויר יהיה להשפיע לרעה על היכולת שלך לשלוט על הדואר יניקה ולחץ. השתמש stereomicroscope עם הגדלה גבוהה למדי ואופטיקה טובה (רצוי לפחות הגדלה 80x). המיצוב של בעל micropipette ואת המחט ניתן לשלוט ידנית על ידי micromanipulator Narishige, כמו זריקות, אך אם הבסיס של stereoscope הוא רחב מדי, כדי לאפשר גישה קלה עם micromanipulator, אז מתאם שמתחבר לגוף של stereomicroscope ניתן גם לרכוש Narishige. הרכבה של micromanipulator חייב להיות יציב מאוד על מנת למנוע העברת רעידות אל המחט השתלת; בסיס מגנטי עובד היטב למטרה זו.
  2. הכנת פיפטה השתלה

    מחטים השתלת עשויים pipettes זכוכית נימי (ראה שתי אפשרויות מתחת לטבלה ריאגנטים) כי נמשכים להתחדד עדין על חולץ אלקטרודה. לשבור את קצה מחט תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות גילוח קצה ישר בנקודה שבה הקוטר הפנימי של המחט הוא מעט גדול יותר התאים להיות מושתלים. החזק את סכיני הגילוח בזווית קלה כדי ליצור שיפוע ולעשות את הפסקה כפי חלקה ככל האפשר, ללא קצוות משוננים. להשתלה בשלב blastula הקוטר החיצוני של המחט צריך למדוד כ 50-60 מ"מ.
  3. עוברים הרכבה להשתלה בתוך תבניות אגר

    הכינו מאכלים על ידי הזרקת צף תבנית פלסטיק עם שורות של בליטות בצורת טריז בצלחת פטרי כי הוא חצי מלא agarose 1.2% מותך EM. לאחר agarose יש הקרושה, להסיר את התבנית, משאירים עובש אגר המכיל שורות של בארות בצורת משולש אחד גדול מספיק כדי להחזיק אחת העובר. ממלאים את התבנית השתלת עם פן / סטרפטוקוקוס EM עומס עוברים שלב blastula בנפרד לתוך הבאר כל אחד עם פיפטה אש זכוכית מלוטשת כך עוברים התורם ממוקמים במורד עמודה אחת ואת עוברי מארח ממוקמים במורד עמודה סמוכים.
  4. השתלת התאים

    עוברים תפקיד בארות השתלת על צדם, למקם עם פיפטה השתלת לפי הצורך במהלך ההשתלה, נזהרת שלא לנקב את החלמון. את המנה עמדה על הבמה, כך שכאשר את המחט נכנסת השתלת העובר, המחט דוחפת את העובר אל הקיר האחורי של טוב שלה. שימוש micromanipulator, מנמיכים את השתלת מחט לתוך צלחת בזווית תלולה למדי. באופן אידיאלי את המחט השתלת צריך להזין את העובר בזווית של כ 45 מעלות. לאחר קצה המחט נמצא מתחת לפני השטח של המדיום העובר, למשוך כמות קטנה של המדיום העובר לתוך המחט על ידי סיבוב הכונן מיקרומטר השליטה מזרק המילטון. עבור שליטה מדויקת ביותר, את הממשק בין שמן מינרלי המדיום העובר צריך להישאר חלק, דק מחודדות של המחט, אבל לא קרוב מדי לקצה. בעדינות עמדת העובר התורם באמצעות מחט ולאחר מכן למשוך את המחט לאחור להזין את כובע blastula העובר במיקום הרצוי. מכה מהירה, קשה יהיה לחדור את העובר ללא גרימת אותו להתגלגל. צייר את התאים התורם לאט ובזהירות אל המחט. אם התאים נלקחים מהר מדי, הם עשויים גזירה. כמו כן, להימנע מלקיחת החלמון לתוך המחט, כפי שזה יהיה לאגד שמן מינרלי, אשר לאחר מכן להרוג את התאים. לאחר המספר הרצוי של תאים תפוסים, להפוך את הלחץ מעט כדי לעצור את השאיבה ולהסיר את המחט מן העובר. תביאו את העובר מארח למצב על ידי העברת צלחת השתלה. שינויים קטנים על המיקום של העובר מארח יכול להתבצע על ידי בעדינות מפנה אותו באמצעות מחט ההשתלה, כל עוד הטיפול נלקח שלא לגעת חלמון. כאשר לגרש את התאים התורם לעובר המארח, למנוע החדרת כמות גדולה של אמצעי העובר או כל שמן מינרלי, כמו זה יכול להפריע להתפתחות או להרוג את העובר. העמדה של תאים לאורך ציר בעלי חיים צמחיים השפעות תרומתם אחת משלוש שכבות נבט, האנדודרם, והמזודרם ו האאקטודרם 2,3. לפיכך, התאים המושתלים קרוב לשוליים לפני תחילת gastrulation יהיה להצמיח מעדיפים את האנדודרם והמזודרם, בעוד התאים המושתלים לכיוון הקוטב חיים תתרום גורלות ectodermal, לרוב האאקטודרם פני השטח, forebrain ועיניים. לכן מידה מסוימת של מיקוד רקמות יכול להתבצע גם בשלבים blastula. לאחר העברת התאים הושלמו, העברת תורם לארח זוגות בארות אגר מצופה צלחת 24 היטב כדי לפתח עוד יותר.
  1. השתלת בשלבים gastrula על המיקרוסקופ מתחם
  1. תיאור לבוש ההשתלה

    העברות שבוצעו על תא תועלת תרכובת מיקרוסקופ מתוך שליטה מדויקת של מיקום המחט שמספקת שמן שלוש ציר הידראוליmicromanipulator. Micromanipulator זו שולטת בתנועות קנס של פיפטה את ההשתלה, ואילו יניקה ב פיפטה נשלטת על ידי מזרק המילטון מיקרומטר כונן דומה לזה המשמש השתלות blastula. מיקרוסקופ מתחם זקוף עם שלב קבוע עדיף לבצע העברות התא מאז התמקדות כזו מיקרוסקופ אינו גורם לעובר לנוע ביחס פיפטה. עם זאת, אם מיקרוסקופ מתכווננת הבמה במתחם יש להשתמש, אז micromanipulator יכול להיות מותקן על הבמה ולא לגופו של מיקרוסקופ עם אפקט דומה. מתאמי המספקים אפשרויות הרכבה micromanipulator או כדי לשלב או גוף של מיקרוסקופים מתחם ממגוון רחב של יצרנים זמינים גם מן Narishige.
  2. הכנת פיפטה השתלה

    מחטים והשתלות מבוצעים למעשה כמתואר לעיל; להשתלה gastrula בשלב הצמצם מחט האידיאלי הוא 30-40 מ"מ. לאחר היווצרות מגן, השכבה העוטפת (EVL) הופך להיות חסיד יותר, מה שהקשה על המחט השתלת לחדור את העובר. כדי להקל על כניסת המחט, למשוך עקיצה על קצה המחט באמצעות microforge. ראשית, חלק את קצה המחט על ידי הבאת אותו קרוב נימה של microforge, ואז להפוך את המחט כך את הקצה המוביל של שפוע יכול ליצור קשר עם החוט. לאחר חוד החנית של המגעים המחט נימה, למשוך אותו משם במהירות כדי ליצור עקיצה, או צלצל. כדי למנוע נזק לתאים, עקיצה צריך להיות ישר את קצה המחט צריכה לא עקומה
  3. עוברים הרכבה להשתלה methylcellulose

    עבור השתלות מיקרוסקופ המתחם, הר עוברים בשקופית דיכאון פתרון 3% methylcellulose (Sigma) מומס בינוני העובר. ראשית, מורחים פס אנכי של methylcellulose בשקע של שקופית זכוכית דיכאון, אז מבול עם כמות נדיבה של המדיום העובר. שימוש pipet אש מלוטש, העברה חד התורם ושלושה מגן בשלב המארחים מתחת לפני השטח של EM בשקופית דיכאון בצד אחד של methylcellulose. בחר עוברים תורם כי הם קצת יותר צעיר המארחים (30-50% epiboly). עם לולאה קטנה שנעשו על ידי הדבקת הקצוות של אורך קצר של 2-lb פס הבדיקה דיג לתוך סוף צינור נימי, בעדינות לגלגל את העוברים התורם לארח עד אל החלק העליון של רצועת methylcellulose וכאלה אותם לתוך methylcellulose עד מאובטחת. אם התאים המושתלים יש ממוקד ידע מסוים מושלם, גורל שלב 3,4 מגן המפה ואת המיקום של רקמת היעד ביחס המגן חיונית כדי לארח עוברי ניתן למקם בצורה נכונה. כאשר עוברים מארח ממוקמות לתוך methylcellulose, לגלגל אותם למצב כך אזור המיקוד הוא העליון, שכן במהלך השתלת המחט ייכנסו העובר בעקיפין, כדי לספק את התאים התורם מבלי לפגוע חלמון.
  4. השתלת התאים

    מקמו את המחט השתלת ידי הזזת אותו לתוך המטוס מוקד של העובר. להתמקד ראשית על העובר התורם באמצעות המטרה 10x. ואז להעביר את העובר בצד, ללא התאמת המטוס מוקד, להשתמש בפקדים של micromanipulator להביא את קצה המחט השתלת אל המוקד. מקם את מחזיק micropipette ואת המחט בזווית רדוד למדי, כך המחט היא קרובה אופקית כמו קצה של דיכאון בשקופית יאפשר. אם עובר מותקן כראוי methylcellulose, זה לא יהיה לגלגל את המחט כמו השתלת נכנס, אלא אם העובר הוא זקן מדי כדי לאפשר המחט לחדור בקלות. השכבה העוטפת נראה להקשיח כמו גיל העובר, ולכן, השתלות gastrula שלב מבוצעות הטובה ביותר מיד לאחר היווצרות מגן. לאחר שלב הכיפה, חלמון שוכן ממש מתחת לתאי כובע blastoderm, אשר בהדרגה מדלל כמו התמורה epiboly. על מנת להימנע פירסינג החלמון, המחט צריכה להיכנס העובר על המטוס מוקד זה רק מעט יותר מזה של EVL. בעת הסרת מספר גדול של תאים מעובר התורם, להזיז את המחט סביב כמו התאים נלקחים, על מנת למנוע בטעות מוצץ החלמון לתוך המחט. אם תאים מעובר one התורם יש להשתיל מארחים מרובים, מומלץ להזין את התורם באמצעות מחט רק פעם אחת על מנת לצמצם את האפשרות של נזק. תאים התורם לאחר מכן ניתן להעביר למיקום הרצוי עד שלושה עוברי המארח. בעת העברת תאים לשניים או יותר עוברים תורם לעובר מארח אחד, הדרך הטובה ביותר היא לקחת תאים מכל אחד העוברים התורם לתוך המחט השתלת אותו לפני השתלת אותם עובר המארח. זה ממזער נזקים לעובר המארח, ומבטיח כי התאים מועברים באותו אזור של העובר, כך ההתנהגויות שלהם ניתן להשוות. מעט מאוד ערבוב OCמוגי לב בין התאים התורם בתוך מחט ההשתלה, ולכן התאים צריכים להיות מועברים לארח אחד כאשר אחד או יותר משמש התורם. על מנת להגדיל את הסבירות שתאי התורם יתרום רקמות הרצוי, לגרש את התאים התורם בעוד המחט נשאבת דרך השטח ממוקדות, בניגוד הפקדת התאים גוש אחד. לאחר העברת התאים הושלמו, מקום השקופית כולה לתוך צלחת פטרי ולהציף בזהירות עם פן / סטרפטוקוקוס EM. במהלך השעות הקרובות methylcellulose תתמוסס, משחררים את העוברים.

דמות 1
איור 1: מיקרוסקופ הגדרת להכנת עוברים chimeric. ת: השתלת לנתח מעטה מיקרוסקופ מורכב מזרק שמן מלא המילטון עם כונן מיקרומטר (א) מחובר למאגר הנפט מלא (ב) ואת השתלת פיפטה (ג) באמצעות 3-דרך שסתום (ד). פיפטה השתלת הוא רכוב על micromanipulator גס (ה) אשר מצורפת לוחית מתכת בסיס (לא מוצג) באמצעות כף הרגל מגנטי (ו). השתלות מתבצעות על הבמה של stereomicroscope (ז) מצויד בתאורה תחתית עבור אופטיקה אופטימלית. ב ': מיקרוסקופ מתחם המתקן מורכב להשתלת כונן שמן מלא מזרק המילטון מיקרומטר דומה (a, b), אך במקרה זה פיפטה השתלת הוא רכוב על בעל פיפטה (ג) מי X, Y ו-Z לתנועות יכול להיות נשלט או על ידי micromanipulator (ה) גס (ד) או קנס. בדוגמה זו, micromanipulator הוא רכוב על הגוף של המיקרוסקופ קבוע הבמה, אולם אפשר גם לעלות אותה על הבמה של מיקרוסקופ רגיל. עוברים, אשר משותק methylcellulose בשקופית דיכאון, הם דמיינו באמצעות המטרה 10x (ו). C: עובש להשתלות עבור משתק עוברים להשתלה stereomicroscope. עוברים Dechorionated מושמטים בנפרד לתוך בארות שנעשו על ידי יציקת זה עובש לתוך agarose בצלחת פטרי 90mm. מידות בארות מוצגים.

דמות 2
איור 2: הרכבה עוברים gastrula בשלב השתלות. ת: צורה אידיאלית של פיפטה השתלת gastrula. שיפוע עם קצה חד עזרי לחדור את העובר. ב ': משתק עוברים התורם המארח methylcellulose. רצועה של methylcellulose הוא הניח בבאר של שקופית דיכאון מוצף כמות נדיבה של המדיום העובר. עוברים מתווספים בינוני העובר והם התגלגלה methylcellulose באמצעות לולאה קטן (ג). DG הגדלה של עוברים באיור. 1B. D: העובר התורם מכוונת כדי לאפשר גישה הקלה ביותר פיפטה, שכן התאים בשלב זה הם עדיין לא מחויב. למשל: מגן בשלב לארח עוברי מכוונים כך באזור היעד העליון. התאים המושתלים לתוך האזורים התאגרף יתרום למוח האחורי הגב ואת הרכס העצבי גולגולתי נגזר שמאל (E) ימינה (G) הצדדים או למוח האחורי הגחון ואת חוט השדרה (F).

דמות 3
איור 3: נציג תמונות של עוברים chimeric.
(AC) עוברים chimeric 18hpf שנוצר על ידי השתלת בשלב מגן שמוצג בתצוגת הגבי, הקדמי בצד שמאל. (A, B) מיון פונקציות שטח פני התא קולטן EphA4 נחשף על ידי ניתוח של עוברים chimeric. לוחות שמאל: המיזוג של rhodamine שכותרתו (rhod.) תאים התורם (אדום) מהונדס GFP מתבטא מגזרים ספציפיים למוח האחורי (ירוק). (א) תאים WT לתרום למוח האחורי כולו של העובר שליטה chimeric. (ב) EphA4-מדולדל תאים התורם אינם נכללים מגזרים ספציפיים למוח האחורי של לארח WT. (ג) בתאים התורמים ממוקד בחלקים שונים של הצינור העצבי מגן בשלב השתלות. התורם תאים (אדום) ממוקד forebrain / המוח התיכון (הפאנל השמאלי) או למוח האחורי / חוט השדרה (פאנל מימין) של לארח WT נגדית מוכתם נוגדן EfnB2a המציין את forebrain, למוח האחורי אמצע הגבול ואת קטע אמצע למוח האחורי (ירוק). סולם ברים: 50μm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הקלות שבה השתלה ניתן להשתמש כדי לייצר מפלצות ממוקד היא אחת המעצמות הגדולות של דג הזברה כמודל החולייתנים. שינוי של פרוטוקול זה לא שתואר לעיל מאפשר ניתוח של תפקוד הגן האימהי עבור הגנים עם תפקידים חיוניים להתפתחות zygotic. מאחר דגים מוטנטים לא יכולים לשרוד עד לבגרות, יש צורך להעביר את germline מוטציה לעובר wild-type אחרת המארח, יצירת "שיבוטים germline" של תאים מוטנטים. יצירת פסיפסים germline כולל השתלת בתאי הנבט בראשיתי מתורם מוטציה לעובר wild-type שורה. בניגוד לכל שושלות תאים אחרים בעובר, השושלת תא הנבט המצוין בשלב מוקדם מאוד של פיתוח על ידי ירושה של הגורמים אימהית 5,6. לפיכך, האתגר הראשון של קבלת פסיפסים germline הוא זיהוי בתאי הנבט הראשוני (PGCs) בעובר התורם. בשלבים midblastula PGCs מתגוררים לאורך השוליים 7,8, כדי להרים 50-100 תאים אקראי מהשוליים של עובר-השושלת שכותרתו התורם לעתים קרובות תוצאות בהעברת PGCs. כאשר הועבר מוט החיה של העובר לארח ללא תווית, בתאי הנבט הראשוני באופן פעיל להגר לעבר בלוטת המין משוערת שבו הם יכולים להיות מזוהים באופן חד משמעי על ידי העמדה האופיינית שלהם, גודל גדול, צבע ושימור בשל קצב איטי שגשוג שלהם 24 שעות של פיתוח 9-11. בינתיים, תורם הנגזרות הלא PGCs תרכוש את גורלו נקבע על ידי מיקומם המארח: בעיקר forebrain ועיניים אם הם הושתלו לקוטב חיה blastula. הזרקת העובר לארח עם morpholinos כי להפיל את הגן למבוי סתום ביעילות לחסל את germline לארח באופן התא אוטונומי, כך גם אחד התורמים הנגזרות PGC יכול לאכלס מחדש את germline כולה 10,12 (CM, תצפית אישית). לאחרונה, קו מהונדס המאפשר PGCs להיות דמיינו בעוברים חיים בשלבים blastula פותחה 13. כאשר חצו לתוך מוטציה אשר תפקוד אימהי יקבע, זה transgene, בשילוב עם morpholinos למבוי סתום, יגרום השתלות germline קליל כי PGCs אחד אפשר לזהות הושתלו מארח germline-מדולדל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

תודה לחברי במעבדה Moens עבור קלט מועיל במהלך כתיבת מאמר זה. HK הוא פוסט דוקטורט נתמך על ידי NIH / NICHD מענק # 5R01HD037909-08. CBM הוא חוקר עם הווארד יוז רפואי במכון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Injection rig Applied Scientific Instrumentation MPPI-3 Foot pedal can be ordered separately
Pronase Sigma-Aldrich P5147 protease type XIV”
Pen-Strep Sigma-Aldrich P4458 100x stock
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M-0387
Fluorescent dextrans Molecular Probes, Life Technologies various Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162)
Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) Sutter Instrument Co. BF120-94-10
Transplant pipette option 1 World Precision Instruments, Inc. TW100-4
Transplant pipette option 2 VWR international #53508-400
micromanipulator Narishige International UMJ-3FC (?)
Micromanipulator magnetic stand Narishige International GJ-1
Transplant apparatus Sutter Instrument Co. MI-10010
Fine micromanipulator Narishige International MMO-203
Depression slides Fisher Scientific 12560A
Agar molds for injection and transplants AL-AN Mfg, Inc.

Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westerfield, M. The Zebrafish Book. 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
  2. Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
  3. Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
  4. Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
  5. Raz, E. Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective. Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).
  6. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124, 3157-3165 (1997).
  7. Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells. Genes Dev. 15, (21), 2877-2885 (2001).
  8. Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells. Development. 126, (23), 5295-5307 (1999).
  9. Weidinger, G. Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target. Development. 129, (1), 25-36 (2002).
  10. Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
  11. Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state. Dev Cell. 3, 723-733 (2002).
  12. Weidinger, G. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).
  13. Blaser, H. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394, doi:10.3791/1394 (2009).More

Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394, doi:10.3791/1394 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter