Summary
एक कदम दर कदम गाइड के प्रत्यारोपण द्वारा ब्लासटुला या गेसट्रुला मंच पर लक्षित chimeric zebrafish भ्रूण पैदा.
Abstract
सबसे शक्तिशाली जटिल विकास की प्रक्रिया में जानकारी हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों के एक chimeric भ्रूण का विश्लेषण है. एक कल्पना जिसमें एक से अधिक पशु कोशिकाओं से एक जीव के रूप में परिभाषित किया गया है, मोज़ाइक कल्पना का एक प्रकार है जिसमें एक से अधिक जीनोटाइप से कोशिकाओं मिश्रित कर रहे हैं, जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती आमतौर पर हैं. Zebrafish में, chimeras आसानी से उपयुक्त भ्रूण चरण में एक दाता भ्रूण से एक मेजबान भ्रूण में कोशिकाओं के प्रत्यारोपण द्वारा किया जा सकता है. लेबल दाता कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट रंजक के रूप में एक वंश मार्कर, एक सेल भ्रूण चरण में, के इंजेक्शन से उत्पन्न कर रहे हैं. लेबल दाता कोशिकाओं दाता भ्रूण से हटा रहे हैं और unlabeled मेजबान एक तेल नियंत्रित ग्लास विंदुक या तो एक परिसर या खुर्दबीन विदारक पर घुड़सवार का उपयोग भ्रूण में पेश किया. दाता कोशिकाओं कुछ मामलों में मेजबान अच्छी तरह से स्थापित भाग्य नक्शे पर आधारित भ्रूण प्रत्यारोपण साइट को चुनने के द्वारा एक विशिष्ट या विकासशील ब्लासटुला या गेसट्रुला मंच मेजबान भ्रूण के क्षेत्र के ऊतकों को लक्षित किया जा सकता है.
Protocol
एक कदम दर कदम गाइड के प्रत्यारोपण द्वारा ब्लासटुला या गेसट्रुला मंच पर लक्षित chimeric zebrafish भ्रूण पैदा.
सबसे शक्तिशाली जटिल विकास की प्रक्रिया में जानकारी हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों के एक chimeric भ्रूण का विश्लेषण है. एक कल्पना जिसमें एक से अधिक पशु कोशिकाओं से एक जीव के रूप में परिभाषित किया गया है, मोज़ाइक कल्पना का एक प्रकार है जिसमें एक से अधिक जीनोटाइप से कोशिकाओं मिश्रित कर रहे हैं, जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती आमतौर पर हैं. Zebrafish में, chimeras आसानी से उपयुक्त भ्रूण चरण में एक दाता भ्रूण से एक मेजबान भ्रूण में कोशिकाओं के प्रत्यारोपण द्वारा किया जा सकता है. लेबल दाता कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट रंजक के रूप में एक वंश मार्कर, एक सेल भ्रूण चरण में, के इंजेक्शन से उत्पन्न कर रहे हैं. लेबल दाता कोशिकाओं दाता भ्रूण से हटा रहे हैं और unlabeled मेजबान एक तेल नियंत्रित ग्लास विंदुक या तो एक परिसर या खुर्दबीन विदारक पर घुड़सवार का उपयोग भ्रूण में पेश किया. दाता कोशिकाओं कुछ मामलों में मेजबान अच्छी तरह से स्थापित भाग्य नक्शे पर आधारित भ्रूण प्रत्यारोपण साइट को चुनने के द्वारा एक विशिष्ट या विकासशील ब्लासटुला या गेसट्रुला मंच मेजबान भ्रूण के क्षेत्र के ऊतकों को लक्षित किया जा सकता है.
भाग 1: एक सेल मंच पर Zebrafish भ्रूण इंजेक्शन.
- एक सेल चरण भ्रूण के enzymatic dechorionation.
Proteolytically dechorionate भ्रूण, ~ एक 0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर pronase समाधान के रूप में Zebrafish 1 बुक में वर्णित में '1-5 के लिए एक सेल मंच पर सेते हैं. Moniter भ्रूण मध्यम में बारीकी से dechorionation और डूब (EM) के साथ / पेन 1 Strep के रूप में जल्द ही के रूप में chorions दिख पतन शुरू भ्रूण. एक बार उनके chorions से जारी है, ब्लासटुला और गेसट्रुला चरण भ्रूण नाजुक रहे हैं और प्लास्टिक की छड़ी या अगर हवा के संपर्क में बिखर जाएगा. इसलिए dechorionated पेन / Strep EM में डूबे हुए भ्रूण, व्यंजन के बीच एक व्यापक बोर आग पॉलिश कांच pipet हस्तांतरण का उपयोग कर रखने के लिए, और या तो अगर लेपित प्लास्टिक (1.2% पेन / Strep EM में agarose) व्यंजन या autoclaved कांच पेट्री डिश में बनाए रखने के. - वंश मार्कर के साथ dechorionated भ्रूण इंजेक्शन .
एक पेट्री तीन तिमाहियों 1.2% agarose पेन में बनाया / EM Strep से भरा पकवान की व्यापक हिस्सा भर में एक 45 डिग्री के कोण पर एक गिलास स्लाइड सम्मिलित करके एक इंजेक्शन पकवान तैयार करें. Agarose solidification के बाद स्लाइड का हटाना एक beveled गर्त छोड़ देता है. एक इंजेक्शन EM / पेन Strep के साथ भरा पकवान की गर्त में dechorionated भ्रूण का स्थानांतरण. वंश मार्कर के 1nl संस्करणों का उपयोग कर सुई ठीक कैलिब्रेटेड आग गिलास इंजेक्शन विंदुक और एक दबाव इंजेक्शन रिग, Zebrafish 1 बुक में वर्णित के रूप में खींच लिया. और 4 सेल चरणों - 1 के बीच dechorionated भ्रूण की जर्दी में सीधे इंजेक्षन रंगों और कम आणविक वजन वंश tracers. फ्लोरोसेंट dextran के एक 3% समाधान chimeric भ्रूण में दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं के विकास के कई दिनों के माध्यम से पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त है. जब वंश मार्कर एक mRNA एन्कोडिंग एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (उदाहरण GFP, या आरएफपी के लिए) है, जल्दी एक सेल चरण भ्रूण के कक्ष में सीधे इंजेक्षन. - वंश मार्कर के साथ गैर - dechorionated भ्रूण इंजेक्शन .
EM में कुओं chorion व्यास के रूप में मोटे तौर पर समान चौड़ाई के साथ एक साँचे में ढालना के आसपास 1.2% agarose solidifying द्वारा बहु - अच्छी तरह से इंजेक्शन व्यंजन तैयार. एक बहु - अच्छी तरह से इंजेक्शन पेन के साथ आधा भरा / EM Strep पकवान में गैर - dechorionated भ्रूण स्थानांतरण. अतिरिक्त तरल पदार्थ निकालें. इस प्रकार immobilized, भ्रूण वंश मार्कर के 1nl संस्करणों के साथ अंतःक्षिप्त किया जा सकता है ऊपर वर्णित के रूप में. - इंजेक्शन भ्रूण प्रत्यारोपण के लिए स्थापना.
कम घनत्व (पकवान प्रति 40-50 भ्रूण) पर भ्रूण ताजा पेन में उठाएँ / EM Strep. दाता और मेजबान भ्रूण प्रत्यारोपण के लिए काफी बारीकी से इस्तेमाल किया स्टेज मैच. ढाल चरण प्रत्यारोपण दाताओं के लिए उद्देश्य थोड़ा मेजबान के पीछे, कृपया ध्यान दें कि इंजेक्शन भ्रूण थोड़ा देरी हो जाते हैं. अलग तापमान, 25 डिग्री सेल्सियस, 28 डिग्री सेल्सियस, और 31 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेते हैं, उनके विकास डगमगाते और जिस पर प्रत्यारोपण किया जा सकता है समय खिड़की को अधिकतम.
भाग 2: प्रत्यारोपण द्वारा chimeric zebrafish भ्रूण बनाना.
- ब्लासटुला चरणों में stereomicroscope पर ट्रांसप्लांटेशन
- ब्लासटुला प्रत्यारोपण रिग के लिए विवरण
zebrafish ब्लासटुला में कोशिका प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया तंत्र एक micrometer ड्राइव नियंत्रित हैमिल्टन (10 एल 50 एल) सिरिंज एक तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी से खनिज तेल के एक जलाशय के लिए और एक micropipette धारक को लचीला टयूबिंग की लंबाई के माध्यम से संलग्न होते . प्रत्यारोपण रिग कोडांतरण के बाद, यह खनिज तेल के साथ भरा है, ध्यान लेने के लिए इस प्रणाली से सभी हवाई बुलबुले को खत्म करने. एक हवाई बुलबुले की उपस्थिति नकारात्मक प्रभाव होगा अपने वें नियंत्रित करने की क्षमताई चूषण और दबाव. काफी उच्च बढ़ाई और अच्छी प्रकाशिकी (कम से कम आदर्श 80x बढ़ाई) के साथ एक stereomicroscope का प्रयोग करें. micropipette धारक और सुई की स्थिति Narishige पुस्तिका micromanipulator के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, के रूप में इंजेक्शन के लिए, तथापि, यदि स्टिरियोस्कोप के आधार बहुत व्यापक है micromanipulator के साथ आसान उपयोग की अनुमति है, तो एक adapter है कि के शरीर के लिए देता है stereomicroscope Narishige से भी खरीदा जा सकता है है. micromanipulator के बढ़ते बहुत स्थिर होना चाहिए क्रम में प्रत्यारोपण सुई कंपन स्थानांतरित करने से बचने के, एक चुंबकीय आधार पर इस उद्देश्य के लिए अच्छी तरह से काम करता है. - प्रत्यारोपण विंदुक तैयारी
ट्रांसप्लांटेशन सुइयों गिलास केशिका pipettes (अभिकर्मकों नीचे दी गई तालिका में दो विकल्प देखें) है कि एक इलेक्ट्रोड खींचने पर एक सज्जन शंकु के लिए तैयार कर रहे हैं से बना रहे हैं. एक विदारक बिंदु जहां सुई की भीतरी व्यास थोड़ा बड़ा है की तुलना में कोशिकाओं प्रतिरोपित किया जा करने के लिए है पर एक सीधे बढ़त razorblade का उपयोग कर खुर्दबीन के नीचे सुई बंद की नोक तोड़ो. बेवल बनाने के लिए और संभव के रूप में चिकनी के रूप में में तोड़ने के लिए एक मामूली कोण पर कोई दांतेदार किनारों के साथ razorblade, पकड़ो. ब्लासटुला चरण प्रत्यारोपण के लिए सुई की बाहरी व्यास लगभग 50-60 मिमी उपाय करना चाहिए. - प्रत्यारोपण के लिए अगर नए नए साँचे में बढ़ते भ्रूण
कि EM में पिघला हुआ 1.2% agarose के साथ आधा भरा है एक पेट्री डिश में पच्चर के आकार का protrusions के पंक्तियों के साथ एक प्लास्टिक मोल्ड तैरते द्वारा इंजेक्शन व्यंजन तैयार करें. एक बार agarose जम गया है, टेम्पलेट निकालने के लिए, अगर साँचे में ढालना है कि triangularly आकार प्रत्येक बस काफी बड़े के लिए एक भ्रूण पकड़ कुओं की पंक्तियाँ हैं छोड़ने. पेन / Strep EM के साथ प्रत्यारोपण मोल्ड भरें और ब्लासटुला चरण भ्रूण व्यक्तिगत एक आग पॉलिश कांच विंदुक ताकि दाता भ्रूण नीचे एक स्तंभ और मेजबान भ्रूण नीचे सन्निकट स्तंभ रखा जाता है रखा जाता है के साथ एक अच्छी तरह से में लोड. - रोपाई कोशिकाओं
प्रत्यारोपण के रूप में प्रत्यारोपण के दौरान जरूरत विंदुक के साथ अपने पक्ष पर प्रत्यारोपण कुओं में स्थिति भ्रूण, स्थान, देखभाल की जर्दी लेने पंचर नहीं. स्थिति मंच पर पकवान तो है कि जब प्रत्यारोपण सुई एक भ्रूण में प्रवेश करती है, सुई इसकी अच्छी तरह के पीछे की दीवार के खिलाफ भ्रूण धक्का. Micromanipulator का प्रयोग, पकवान में एक काफी तेजी से कोण पर प्रत्यारोपण सुई कम. आदर्श रूप में प्रत्यारोपण सुई लगभग एक 45 डिग्री के कोण पर भ्रूण दर्ज करना चाहिए. एक बार सुई की नोक भ्रूण मध्यम की सतह से नीचे है, सुई में सुक्ष्ममापी हैमिल्टन सिरिंज को नियंत्रित ड्राइव घुमा द्वारा भ्रूण माध्यम की एक छोटी राशि आकर्षित. सबसे सटीक नियंत्रण के लिए, खनिज तेल और भ्रूण मध्यम के बीच इंटरफेस पतली, सुई का पतला भाग में रहते हैं, चाहिए, लेकिन अंत तक भी बंद नहीं. धीरे सुई के साथ दाता भ्रूण की स्थिति और तो सुई वापस खींचना और इच्छित स्थान पर भ्रूण के ब्लासटुला टोपी दर्ज करें. यह रोल करने के लिए कारण के बिना एक तेजी से कठिन मारा भ्रूण घुसना होगा. सुई में दाता कोशिकाओं ड्रा धीरे से और ध्यान. यदि कोशिकाओं को भी जल्दी ले रहे हैं, वे कतरनी की संभावना हैं. इसके अलावा जर्दी सुई में लेने से बचने के रूप में यह खनिज तेल है, जो फिर कोशिकाओं को मारने करेंगे करने के लिए बाध्य होगा. कक्षों की इच्छित संख्या के बाद लिया जाता है, दबाव थोड़ा रिवर्स करने के लिए चूषण रोक और भ्रूण से सुई हटायें. स्थिति में मेजबान भ्रूण प्रत्यारोपण पकवान चलती द्वारा लाओ. मेजबान भ्रूण की स्थिति के लिए लघु समायोजन धीरे यह मोड़ प्रत्यारोपण, सुई के रूप में लंबे समय के रूप में देखभाल की जर्दी स्पर्श नहीं लिया जाता है का उपयोग करके बनाया जा सकता है. जब मेजबान भ्रूण में दाता कोशिकाओं को खदेड़ने, भ्रूण मध्यम या किसी भी खनिज तेल की एक बड़ी राशि शुरू करने के रूप में इस विकास के साथ हस्तक्षेप या भ्रूण मार सकता से बचने के. पशु वनस्पति अक्ष के साथ कोशिकाओं की स्थिति तीन रोगाणु परतें, endoderm, mesoderm, और 2,3 बाह्य त्वक स्तर के लिए उनके योगदान को प्रभावित करती है. तदनुसार, gastrulation की शुरुआत से पहले मार्जिन करीब प्रतिरोपित कोशिकाओं endoderm और mesoderm के लिए preferentially वृद्धि देते हैं, जबकि पशु पोल ओर प्रतिरोपित कोशिकाओं बहिर्जनस्तरीय भाग्य, सबसे अधिक सतह बाह्य त्वक स्तर, अग्रमस्तिष्क और आंखों के लिए योगदान देगा. इस प्रकार के ऊतकों को निशाना बनाने का एक डिग्री ब्लासटुला चरणों में भी पूरा कर सकते हैं. सेल स्थानान्तरण के बाद पूरा हो गया है, एक 24 अच्छी तरह से थाली की अगर लेपित कुओं दाता मेजबान जोड़े को हस्तांतरण करने के लिए और अधिक विकसित.
- यौगिक सूक्ष्मदर्शी पर गेसट्रुला चरणों में ट्रांसप्लांटेशन
- प्रत्यारोपण रिग का विवरण
सेल स्थानान्तरण एक तीन अक्ष हाइड्रोलिक तेल द्वारा प्रदान की सुई की स्थिति का सटीक नियंत्रण से एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी लाभ पर प्रदर्शनmicromanipulator. यह micromanipulator प्रत्यारोपण विंदुक के ठीक आंदोलनों नियंत्रण, जबकि पिपेट में चूषण एक micrometer ड्राइव हैमिल्टन ब्लासटुला प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया एक के लिए इसी तरह की सिरिंज द्वारा नियंत्रित किया जाता है. एक निश्चित मंच के साथ एक ईमानदार यौगिक सूक्ष्मदर्शी बेहतर है इस तरह के एक खुर्दबीन ध्यान केंद्रित के बाद सेल स्थानान्तरण प्रदर्शन करने के लिए भ्रूण विंदुक के लिए रिश्तेदार को स्थानांतरित करने के लिए कारण नहीं करता है. हालांकि, अगर एक समायोज्य चरण यौगिक माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया जाना चाहिए, तो micromanipulator एक ही प्रभाव के साथ मंच पर बजाय माइक्रोस्कोप के शरीर के लिए मुहिम शुरू किया जा सकता है. Adaptors कि micromanipulator बढ़ते निर्माताओं की एक किस्म से मंच या यौगिक सूक्ष्मदर्शी शरीर या तो के लिए विकल्प प्रदान करते हैं Narishige से भी उपलब्ध हैं. - प्रत्यारोपण विंदुक तैयारी
ट्रांसप्लांटेशन सुइयों बना रहे हैं अनिवार्य रूप से के रूप में ऊपर वर्णित, गेसट्रुला चरण के प्रत्यारोपण के लिए आदर्श सुई एपर्चर 30-40 मिमी है. ढाल के गठन के बाद, घेर परत (EVŁ) और अधिक पक्षपाती हो जाता है, यह प्रत्यारोपण सुई भ्रूण घुसना करने के लिए मुश्किल बनाने के लिए. सुई प्रविष्टि की सुविधा के लिए, एक सुई का उपयोग microforge के अंत पर एक आँकड़ी खींच. सबसे पहले, इसे लाने के microforge के फिलामेंट के लिए करीब से सुई की नोक चिकनी, तो सुई इतनी बारी है कि बेवेल के अग्रणी धार फिलामेंट के साथ संपर्क कर सकते हैं. सुई फिलामेंट संपर्कों के अग्रणी धार में एक बार, इसे जल्दी से दूर खींचने के लिए एक कंटिया, भाला या बनाने के. हानिकारक कोशिकाओं से बचने के लिए, कंटिया सीधे हो सकता है और सुई की नोक वक्र नहीं करना चाहिए करना चाहिए - प्रत्यारोपण के लिए methylcellulose में बढ़ते भ्रूण
यौगिक सूक्ष्मदर्शी प्रत्यारोपण के लिए, methylcellulose (सिग्मा) के एक 3% समाधान भ्रूण माध्यम भंग में एक अवसाद स्लाइड पर भ्रूण माउंट. सबसे पहले, एक गिलास स्लाइड अवसाद, भ्रूण मध्यम के एक उदार राशि के साथ तो बाढ़ के अवसाद में एक methylcellulose के ऊर्ध्वाधर पट्टी धब्बा. आग पॉलिश pipet का प्रयोग, methylcellulose के एक तरफ अवसाद स्लाइड पर EM की सतह के नीचे एक दाता और तीन ढाल मंच मेजबान हस्तांतरण. दाता भ्रूण है कि थोड़ा मेजबान (30-50% epiboly) की तुलना में छोटी हैं चुनें. एक केशिका ट्यूब के अंत में एक 2 पौंड परीक्षण मछली पकड़ने की रेखा से कम लंबाई के सिरों gluing द्वारा किए गए एक छोटे से पाश के साथ, धीरे दाता और मेजबान भ्रूण रोल methylcellulose पट्टी के शीर्ष पर और methylcellulose में उन्हें नीचे सामान सुरक्षित जब तक. यदि प्रतिरोपित कोशिकाओं को ढाल चरण भाग्य की एक विशेष डोमेन ज्ञान, 3,4 नक्शा और लक्ष्य के ऊतकों की ढाल करने के लिए सापेक्ष स्थिति आवश्यक है इतना है कि मेजबान भ्रूण सही ढंग से तैनात किया जा सकता करने के लिए लक्षित किया जा रहे हैं. के रूप में मेजबान भ्रूण methylcellulose में रखा जाता है, स्थिति में उन्हें इतना है कि लक्षित क्षेत्र है ऊपरवाला रोल, के बाद से सुई भ्रूण प्रत्यारोपण के दौरान tangentially दर्ज करें जर्दी को नुकसान पहुँचाए बिना दाता कोशिकाओं देने. - रोपाई कोशिकाओं
यह भ्रूण के फोकल हवाई जहाज़ में बढ़ द्वारा प्रत्यारोपण सुई की स्थिति. दाता 10x उद्देश्य का उपयोग भ्रूण पर पहले ध्यान केंद्रित. तब तरफ से भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए, और फोकल हवाई जहाज़ का समायोजन के बिना, micromanipulator के नियंत्रण का उपयोग को ध्यान में प्रत्यारोपण सुई की नोक लाने. एक काफी उथले कोण पर स्थिति micropipette धारक और सुई, इसलिए है कि सुई के रूप में क्षैतिज करने के लिए करीब है के रूप में स्लाइड पर अवसाद के किनारे की अनुमति देगा. यदि एक भ्रूण ठीक methylcellulose में मुहिम शुरू की है, यह प्रत्यारोपण सुई के रूप में प्रवेश करती है, रोल नहीं होगा जब तक भ्रूण सुई आसानी से घुसना करने की अनुमति भी पुराना है. घेर परत करने के लिए कड़ा भ्रूण उम्र के रूप में, इसलिए, गेसट्रुला चरण प्रत्यारोपण सबसे सही ढाल के गठन के बाद प्रदर्शन कर रहे हैं लगता है. गुंबद चरण के बाद, जर्दी blastoderm टोपी, जो उत्तरोत्तर epiboly आय के रूप में thins कोशिकाओं बस के नीचे रहता है. आदेश में जर्दी भेदी से बचने के लिए, सुई एक नाभीय विमान है कि बस थोड़ा EVŁ की तुलना में गहरी है पर भ्रूण में प्रवेश करना चाहिए. जब दाता भ्रूण से कोशिकाओं की बड़ी संख्या को हटाने के रूप में कक्षों को ले रहे हैं आसपास सुई को स्थानांतरित करने के लिए आदेश में गलती से बचने के लिए सुई में जर्दी चूसने. यदि एक दाता भ्रूण से कोशिकाओं एकाधिक मेजबान को प्रत्यारोपित किया जा रहे हैं, यह सबसे अच्छा है सुई के साथ दाता केवल एक बार में प्रवेश क्रम में नुकसान की संभावना कम से कम है. दाता कोशिकाओं तो इच्छित स्थान पर स्थानांतरित किया जा सकता है में तीन मेजबान भ्रूण करने के लिए. जब एक मेजबान भ्रूण में दो या दो से अधिक दाता भ्रूण कोशिकाओं से स्थानांतरित, यह सबसे अच्छा है दाता भ्रूण के प्रत्येक कोशिकाओं से एक ही प्रत्यारोपण सुई में उन्हें एक मेजबान भ्रूण प्रत्यारोपण से पहले ले. यह मेजबान भ्रूण को नुकसान कम से कम, और यह सुनिश्चित करता है कि कोशिकाओं को भ्रूण की एक ही क्षेत्र में स्थानांतरित कर रहे हैं, ताकि उनके व्यवहार की तुलना में किया जा सकता है. बहुत कम oc मिश्रणसुई के भीतर प्रत्यारोपण दाता कोशिकाओं के बीच curs, इसलिए, कोशिकाओं एक एकल मेजबान जब एक से अधिक दाता प्रयोग किया जाता है के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए. के क्रम में संभावना है कि दाता कोशिकाओं वांछित ऊतक के लिए योगदान देगा को बढ़ाने के लिए दाता कोशिकाओं को निष्कासित जबकि सुई लक्षित क्षेत्र के माध्यम से तैयार किया जा रहा है, के रूप में एक एकल पेड़ों का झुरमुट में कोशिकाओं को जमा करने का विरोध किया. एक बार सेल के हस्तांतरण को पूरा कर रहे हैं, एक पेट्री डिश और बाढ़ में पूरी स्लाइड जगह ध्यान से पेन / Strep EM के साथ. अगले कुछ ही घंटों में methylcellulose भंग, भ्रूण रिहा.
चित्रा 1: chimeric भ्रूण बनाने के लिए सेट अप माइक्रोस्कोप . एक: एक विदारक माइक्रोस्कोप प्रत्यारोपण रिग एक तेल से भरे एक micrometer ड्राइव () एक 3 तरह से पानी निकलने की टोंटी (घ) के माध्यम से एक तेल से भरे जलाशय (ख) और प्रत्यारोपण विंदुक (ग) से जुड़ा के साथ हैमिल्टन सिरिंज के होते हैं. प्रत्यारोपण विंदुक एक मोटे micromanipulator (ई) जो एक चुंबकीय पैर (च) के माध्यम से एक धातु बेस प्लेट (नहीं दिखाया गया है) से जुड़ा हुआ है पर मुहिम शुरू की है. प्रत्यारोपण (छ) stereomicroscope इष्टतम प्रकाशिकी के लिए नीचे प्रकाश व्यवस्था के साथ सुसज्जित के मंच पर प्रदर्शन कर रहे हैं. बी: एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी प्रत्यारोपण रिग एक समान ड्राइव तेल भरे हैमिल्टन सिरिंज और सुक्ष्ममापी (एक, ख) के होते हैं, लेकिन इस मामले में प्रत्यारोपण विंदुक विंदुक (ग) एक्स, वाई और जेड आंदोलनों धारक जिसका नियंत्रित किया जा सकता पर मुहिम शुरू की है या तो एक मोटे (घ) या ठीक micromanipulator (ई) के द्वारा. इस उदाहरण में, micromanipulator एक निश्चित अवस्था खुर्दबीन के शरीर पर मुहिम शुरू की है, लेकिन यह भी संभव है यह एक नियमित रूप से खुर्दबीन के मंच पर माउंट. भ्रूण, जो एक अवसाद स्लाइड पर methylcellulose में immobilized कर रहे हैं एक 10x उद्देश्य (च) कल्पना का उपयोग कर रहे हैं. सी: stereomicroscope प्रत्यारोपण के लिए भ्रूण immobilizing के लिए प्रत्यारोपण ढालना. Dechorionated भ्रूण व्यक्तिगत agarose में एक 90mm पेट्री डिश में इस मोल्ड कास्टिंग द्वारा बनाई गई कुओं में गिरा रहे हैं. कुओं के आयाम दिखाए जाते हैं.
चित्रा 2: गेसट्रुला मंच प्रत्यारोपण के लिए भ्रूण बढ़ते . एक: एक गेसट्रुला प्रत्यारोपण विंदुक के आदर्श आकार. एक तेज टिप के साथ एक बेवल भ्रूण मर्मज्ञ में एड्स. बी: methylcellulose में दाता और मेजबान भ्रूण immobilizing. Methylcellulose की एक पट्टी के नीचे एक अवसाद स्लाइड की अच्छी तरह से में रखी है और भ्रूण मध्यम के एक उदार राशि के साथ पानी भर गया. भ्रूण भ्रूण माध्यम से जोड़ रहे हैं और एक छोटे से पाश (सी) का उपयोग methylcellulose पर लुढ़का. छवि में भ्रूण के महानिदेशक इज़ाफ़ा. 1B. डी: दाता भ्रूण विंदुक के लिए आसान पहुँच की अनुमति उन्मुख है, के बाद से इस स्तर पर कोशिकाओं को अभी भी अवचनबद्ध हैं. उदा: मेजबान शील्ड चरण भ्रूण उन्मुख कर रहे हैं ताकि लक्षित क्षेत्र सबसे ऊपर है. बॉक्सिंग क्षेत्रों में प्रतिरोपित कोशिकाओं पृष्ठीय hindbrain और कपाल तंत्रिका शिखा (ई) बाएँ और दाएँ पक्ष (G) से या उदर hindbrain और रीढ़ की हड्डी (एफ) के लिए प्राप्त करने के लिए योगदान देगा.
चित्रा 3: chimeric भ्रूण के प्रतिनिधि छवियों.
(एसी) 18hpf chimeric ढाल पृष्ठीय दृश्य में दिखाया चरण में भ्रूण प्रत्यारोपण द्वारा उत्पन्न, छोड़ दिया करने के लिए पूर्वकाल. (ए, बी) छंटनी कोशिका की सतह रिसेप्टर EphA4 के लिए कार्य chimeric भ्रूण के विश्लेषण से पता चला. वाम पैनल: मर्ज rhodamine लेबल (rhod.) दाता कोशिकाओं (लाल) और ट्रांसजेनिक GFP विशिष्ट hindbrain क्षेत्रों (हरा) में व्यक्त की. (ए) WT कोशिकाओं एक नियंत्रण chimeric भ्रूण के पूरे hindbrain के लिए योगदान. (बी) EphA4 समाप्त दाता कोशिकाओं के विशिष्ट क्षेत्रों से एक WT मेजबान के hindbrain अपवर्जित कर रहे हैं. (सी) दाता कोशिकाओं को ढाल मंच प्रत्यारोपण में न्यूरल ट्यूब के विभिन्न भागों के लिए लक्षित है. दाता कोशिकाओं (लाल) अग्रमस्तिष्क / midbrain (बाएं पैनल) एक WT काउंटर से सना हुआ एक EfnB2a एंटीबॉडी कि अग्रमस्तिष्क निशान, मध्य hindbrain सीमा और के बीच खंड के साथ मेजबान के hindbrain / या रीढ़ की हड्डी (सही पैनल) लक्षित hindbrain (हरा). स्केल की सलाखों: 50μm.
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Discussion
कितनी आसानी के साथ जो प्रत्यारोपण के लिए लक्षित chimeras उत्पादन किया जा सकता एक हड्डीवाला मॉडल के रूप में zebrafish के महान शक्तियों में से एक है. इस वर्णित से ऊपर नहीं प्रोटोकॉल के एक संशोधन zygotic विकास में आवश्यक भूमिकाओं के साथ जीन के लिए मातृ जीन समारोह का विश्लेषण की अनुमति देता है. चूंकि इन उत्परिवर्ती मछली वयस्कता तक जीवित नहीं रह सकते, यह आवश्यक है एक अन्यथा मेजबान जंगली प्रकार भ्रूण में उत्परिवर्ती germline हस्तांतरण, "germline क्लोन" उत्परिवर्ती कोशिकाओं के बनाने. उत्पन्न germline मोज़ाइक रोपाई एक उत्परिवर्ती दाता से एक मेजबान जंगली प्रकार भ्रूण करने के लिए मौलिक जर्म कोशिकाओं शामिल है. भ्रूण में अन्य सभी सेल प्रजातियों के विपरीत, रोगाणु सेल वंश के विकास में बहुत जल्दी मातृ 5,6 निर्धारकों की विरासत के द्वारा निर्दिष्ट है. इस प्रकार, germline मोज़ाइक बनाने की पहली चुनौती दाता भ्रूण में मौलिक जर्म कोशिकाओं (PGCs) की पहचान है. Midblastula चरणों में PGCs 7,8 मार्जिन के साथ रहते हैं, तो एक वंश - लेबल दाता भ्रूण के मार्जिन से 50-100 यादृच्छिक कोशिकाओं उठा अक्सर PGCs के हस्तांतरण में परिणाम है . जब एक unlabeled मेजबान भ्रूण के पशु पोल करने के लिए हस्तांतरित, मौलिक जर्म कोशिकाओं सक्रिय रूप से प्रकल्पित जननपिंड जहां वे असंदिग्ध रूप से उनकी विशेषता स्थिति, बड़े आकार, और डाई उनके धीमी proliferative दर के कारण प्रतिधारण द्वारा किया जा सकता है विकास के 24 घंटे में पहचान की ओर विस्थापित 9-11. इस बीच, दाता व्युत्पन्न गैर PGCs मेजबान में उनके स्थान द्वारा निर्धारित भाग्य को प्राप्त होगा: मुख्य रूप से अग्रमस्तिष्क और आँखें अगर वे ब्लासटुला पशु पोल को प्रत्यारोपित किया गया. Morpholinos कि नीचे मरा हुआ अंत जीन दस्तक के साथ मेजबान भ्रूण इंजेक्शन प्रभावी ढंग से एक सेल स्वायत्त तरीके में मेजबान germline ऐसा खत्म करने, कि यह भी एक एकल दाता व्युत्पन्न PGC पूरे 10,12 germline (मुख्यमंत्री, व्यक्तिगत प्रेक्षण) जनसंख्या फिर से बढ़ा सकते हैं. हाल ही में, एक ट्रांसजेनिक लाइन है कि PGCs ब्लासटुला चरणों के दौरान जीवित भ्रूण में कल्पना अनुमति देता है 13 विकसित किया गया है. जब उत्परिवर्ती जिनकी मातृ समारोह के लिए निर्धारित किया है में पार कर, इस transgene, मरा हुआ अंत morpholinos के साथ संयुक्त, germline प्रत्यारोपण सतही क्योंकि एक PGCs और पहचाना जा सकता है एक मेजबान germline समाप्त में प्रत्यारोपित होगा.
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Acknowledgments
MOENS प्रयोगशाला के सदस्यों को इस लेख के लेखन के दौरान सहायक इनपुट के लिए धन्यवाद. एच बाद डॉक्टरेट साथी / एनआईएच NICHD अनुदान # 5R01HD037909-08 द्वारा समर्थित है. सीबीएम हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट के साथ एक अन्वेषक है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately |
| Pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | protease type XIV” |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4458 | 100x stock |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M-0387 | |
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes, Life Technologies | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter Instrument Co. | BF120-94-10 | |
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | |
| Transplant pipette option 2 | VWR international | #53508-400 | |
| micromanipulator | Narishige International | UMJ-3FC (?) | |
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige International | GJ-1 | |
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | |
| Fine micromanipulator | Narishige International | MMO-203 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | 12560A | |
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. | ||
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose. |
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References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
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