Summary
blastula 또는 gastrula 단계에서 이식의 대상이 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 단계별 가이드.
Abstract
복잡한 개발 프로세스에 대한 통찰력을 얻을하는 데 사용되는 가장 강력한 도구 중 하나는 키메라 배아의 분석이다. 키메라는 하나 이상의 동물에서 세포를 포함하는 유기체로 정의되며 모자이크는 하나 이상의 유전자형의 세포는 일반적으로 야생 - 타입과 돌연변이 혼합되어있는 키메라의 한 종류입니다. zebrafish에서 chimeras은 즉시 적절한 배아 단계에서 호스트 배아에 기증자의 배아에서 세포 이식에 의해 만들 수 있습니다. 표시 기증자 세포는 한 세포 단계의 배아로 같은 형광 염료로 혈통 마커,의 주사에 의해 생성됩니다. 표시 기증자 세포는 기증자의 배아에서 제거하고 화합물 또는 해부 현미경 중 하나에 장착된 오일 제어 유리 피펫을 사용하여 레이블이 지정되지 않은 호스트 배아에 도입하고 있습니다. 기증자 세포가 어떤 경우에는 잘 설립 운명의지도에 따라 호스트 배아에 이식 사이트를 선택하여 개발 blastula 또는 gastrula 무대 호스트 배아의 특정 지역 또는 조직을 대상으로 수 있습니다.
Protocol
blastula 또는 gastrula 단계에서 이식의 대상이 키메라 zebrafish의 배아를 생성하는 단계별 가이드.
복잡한 개발 프로세스에 대한 통찰력을 얻을하는 데 사용되는 가장 강력한 도구 중 하나는 키메라 배아의 분석이다. 키메라는 하나 이상의 동물에서 세포를 포함하는 유기체로 정의되며 모자이크는 하나 이상의 유전자형의 세포는 일반적으로 야생 - 타입과 돌연변이 혼합되어있는 키메라의 한 종류입니다. zebrafish에서 chimeras은 즉시 적절한 배아 단계에서 호스트 배아에 기증자의 배아에서 세포 이식에 의해 만들 수 있습니다. 표시 기증자 세포는 한 세포 단계의 배아로 같은 형광 염료로 혈통 마커,의 주사에 의해 생성됩니다. 표시 기증자 세포는 기증자의 배아에서 제거하고 화합물 또는 해부 현미경 중 하나에 장착된 오일 제어 유리 피펫을 사용하여 레이블이 지정되지 않은 호스트 배아에 도입하고 있습니다. 기증자 세포가 어떤 경우에는 잘 설립 운명의지도에 따라 호스트 배아에 이식 사이트를 선택하여 개발 blastula 또는 gastrula 무대 호스트 배아의 특정 지역 또는 조직을 대상으로 수 있습니다.
파트 1 : 1 - 세포 단계에서 Zebrafish 배아를 주입.
- 1 - 세포 배아 단계의 효소 dechorionation.
Zebrafish 도서 1 설명한 것처럼 0.5 MG / ML pronase 솔루션 ~ 1-5 '에 대한 1 - 세포 단계에서 품어 proteolytically dechorionate 배아에. 펜 / Strep 1로 빨리 chorions가 가시 붕괴 시작과 마찬가지로 엠브료 매체 Moniter의 밀접 dechorionation 및 잠수함 배아 (EM). 일단 자신의 chorions에서 출시 blastula 및 gastrula 무대 배아는 불안정하고 플라스틱에 충실하거나 공기에 노출하면 분해됩니다. 따라서 한천 - 코팅 플라스틱 요리 (1.2 % 펜 / Strep EM의 아가로 오스) 또는 autoclaved 유리 배양 접시 하나에서 펜 / Strep EM에 빠져들 dechorionated 배아, 넓은 구멍 불을 광택 유리 pipet을 사용하여 요리 사이의 전송을 유지하고, 유지합니다. - 혈통 표시와 함께 dechorionated 배아를 주입.
아가로 오스는 펜에서 만든 / EM을 Strep 1.2 %의 4 분의 3 전체 페트리 접시의 넓은 부분에 걸쳐 45도 각도에서 유리 슬라이드를 삽입하여 사출 요리를 준비합니다. 아가로 오스의 응고 후 슬라이드의 제거 beveled 여물을 떠납니다. 펜 / Strep EM 가득 사출 접시의 여물에 dechorionated 배아를 전송합니다. 사용 혈통 마커의 1nl 볼륨을 주사 정확하게 보정 불을 가져온 유리 주입 피펫과 같은 Zebrafish 도서 1에서 설명 압력 분사 장비를. 4 셀 단계 - 직접 1 ~ dechorionated 배아의 노른자에 염료와 낮은 분자 - 중량 혈통으로 추적을 주사. 형광 dextran의 3 % 솔루션은 개발을 통해 몇 일 키메라 배아에서 기증자 파생 세포의 검출 수 있도록 충분합니다. 혈통의 표식은 형광 단백질 (예, GFP 또는 RFP)을 인코딩 mRNA 경우, 초기 1 세포 단계의 배아의 세포에 직접 주입. - 혈통 표시와 함께 비 dechorionated 배아를 주입.
웰스와 금형 chorion 직경으로 대략 같은 너비 주위 EM에서 1.2 % 아가로 오스를 응고하여 멀티 잘 분사 요리를 준비합니다. 멀티 잘 분사 요리 펜과 함께 절반 채워진 / EM을 Strep에 비 dechorionated 배아를 전송합니다. 초과 액체를 제거합니다. 위에서 설명한대로 따라서 고정화, 배아는 혈통 마커의 1nl 볼륨 주입 수 있습니다. - 이식을위한 주입 태아를 양육.
신선한 펜에서 저밀도 (접시 당 40-50 배아)에서 배아를 높이 / EM을 Strep. 상당히 밀접하게 이식에 사용되는 기증자와 호스트 배아를 무대 일치합니다. 에 대한 보호막 단계 이식, 약간 호스트 뒤에 지연에 기증자 목표, 주입 태아가 약간 지연하는 경향이 있습니다. 자신의 개발을 비틀 이식을 수행할 수있는 이상의 시간 창을 최대화하기 위해 서로 다른 온도 25 ° C, 28 ° C, 31 ° C에서 배아를 품어.
2 부 : 이식하여 키메라 zebrafish의 배아를 만들기.
- stereomicroscope에 blastula 단계에서 이식
- blastula에 대한 이식 장비에 대한 설명
zebrafish blastula에서 세포 이식에 사용되는 장치는 유연한 튜브의 길이를 통해 미네랄 오일의 저수지와 micropipette 홀더에 세 방향 꼭지가 부착된 마이크로 미터 운전 제어 해밀턴 주사기 (10리터 - 50 L)로 구성되어 있습니다 . 이식 장비를 조립하면, 그것은 시스템에서 모든 기포를 제거하기 위해 간병, 미네랄 오일로 가득 차 있습니다. 기포의 존재는 부정적인 일을 제어하는 능력에 영향을 것입니다전자 흡입과 압력. 매우 높은 배율 좋은 광학 (이상 적어도 80x의 배율)로 stereomicroscope를 사용하십시오. micropipette 홀더와 바늘의 위치는 주사에 대해서, Narishige 매뉴얼 micromanipulator에 의해 제어할 수 있지만, 입체경의 기본은 다음 micromanipulator 쉽게 액세스를 허용하기 위해 본문에 첨부 어댑터 너무 넓은 경우 stereomicroscope도 Narishige에서 구입하실 수 있습니다. micromanipulator의 설치는 이식 바늘에 진동을 전송하지 않도록하기 위해서는 매우 안정되어야하며 자기 기준이 목적을 위해 잘 작동합니다. - 이식 피펫 준비
이식의 바늘은 전극 풀러에 부드러운 테이퍼로 그려 유리 모세관 pipettes (시약 테이블 아래에 다음 두 가지 옵션을 참조)에서 만들어집니다. 바늘의 내경은 세포 이식으로보다 약간 큰 지점에서 직선 모서리 razorblade를 사용하여 해부 현미경으로 바늘 해제의 팁을 휴식. 없이 계단 모서리와 베벨을 생성하고 가능한 한 매끄러운로 브레이크를 만들기 위해 약간의 각도에서 razorblade 잡아. blastula 무대 이식 바늘의 외경은 약 50-60밀리미터을 측정해야합니다. - 한천 금형에 이식 장착 배아
EM에서 용융 1.2 % 아가로 오스와 반 가득 배양 접시에있는 쐐기 모양의 라고나할까요 늘어서있는 플라스틱 금형을 부동하여 사출 요리를 준비합니다. 아가로 오스가 확정되면, 한 배아를 잡아만큼 각 단지 큰 triangularly 모양의 우물의 행을 포함하는 한천 금형을 떠나, 템플릿을 제거합니다. 펜 / Strep EM과 이식의 금형을 기입하여 기증자의 배아가 하나의 열로 표시하고 호스트 태아가 인접한 열을 아래로 배치를 배치되도록 화재 광택 유리 피펫 각 우물에 개별적으로 blastula 무대 배아를로드합니다. - 이식 세포
자신의 양쪽에 이식 우물의 위치 배아는, 소중히 노른자를 치료하지 복용 등 이식하는 동안 필요한 이식 피펫로 재지정합니다. 무대에 위치 접시 있도록 이식 바늘이 배아를 입력하면 바늘은 잘 뒤쪽 벽에 배아를 못살게 굴지. micromanipulator 사용하여 상당히 가파른 각도로 그릇에 이식 바늘을 낮추십시오. 이상적으로 이식 바늘은 약 45도 각도에서 배아를 입력해야합니다. 바늘 끝이 아래의 배아 매체의 표면되면, 해밀턴 주사기를 제어하는 마이크로 드라이브를 왜곡하여 바늘로 배아 매체의 작은 금액을 그립니다. 가장 정확한 컨트롤은 광유와 배아 매체 사이의 인터페이스는 바늘의 얇은, 테이퍼 부분에 남아 있어야하지만, 너무 다가올 수 없습니다. 부드럽게 바늘로 기증자의 배아를 위치 후 다시 바늘을 그릴하고 원하는 위치에 배 (胚)의 blastula 모자를 입력합니다. 신속, 타격은 롤 발생하지 않고 배아를 침투합니다. 바늘로 천천히 조심스럽게 기증자 세포를 그립니다. 세포가 너무 빨리 이동하는 경우, 그들은 전단 가능성이 있습니다. 그 다음 세포를 죽일 것이다 미네랄 오일,에 바인딩되므로 또한, 바늘에 노른자를 복용하지 마십시오. 세포의 원하는 번호가 최대 촬영 후 흡입을 중지 약간 압력을 반대하고 배아에서 바늘을 제거합니다. 이식 요리를 이동하여 위치로 호스트의 배아를 가져와. 호스트 배아의 위치에 작은 조정은 부드럽게 치료가 노른자를 만지지로 이동합니다만큼 이식 바늘을 사용하여 그것을 전환하여 만들 수 있습니다. 호스트 배아에 기증자의 세포를 추방하면, 이것은 개발을 방해하거나 태아를 죽일 수로 배아 매체 또는 미네랄 오일의 다량을 도입하지 마십시오. 동물 - 식물 축을 따라 세포의 위치는 세 배아 레이어, endoderm, mesoderm, ectoderm과 2,3 중 하나에 자신의 기여에 영향을 미칩니다. 동물 극쪽으로 이식 세포가 ectodermal의 운명, 가장 일반적으로 표면 ectoderm, forebrain 눈과에 기여하는 동안 따라서, 이전 gastrulation의 처음으로 가까운 여백에 이식 세포가, endoderm 및 mesoderm에 우선적으로 상승을 제공합니다. 따라서 조직 타겟팅의 정도는 blastula 단계도 수행할 수 있습니다. 셀 전송이 완료되면 더욱 개발하기 위해 24 잘 접시의 한천 코팅 우물에 기증 - 호스트 쌍을 전송할 수 있습니다.
- 복합 현미경에 gastrula 단계에서 이식
- 장기 이식 장비에 대한 설명
셀 전송 유압 3 축 기름에 의해 제공 바늘 위치의 정확한 컨트롤에서 복합 현미경의 혜택에서 수행micromanipulator. 피펫으로 흡입이 blastula 이식에 사용되는 것과 유사한 마이크로 미터 - 드라이브 해밀턴 주사기에 의해 제어되는 동안이 micromanipulator은 이식 피펫의 좋은 움직임을 제어합니다. 고정 무대와 수직 복합 현미경은 현미경을 집중 이후 셀 전송을 수행하기위한 배아는 피펫에 상대적으로 이동하는 원인이되지 않습니다 바람직합니다. 조절 단계 복합 현미경을 사용해야하는 경우 단, 다음 micromanipulator는 동일한 효과와 함께 무대보다는 현미경의 본문에 장착할 수 있습니다. 제조 업체의 다양한 복합 현미경의 무대 또는 몸 하나에 micromanipulator를 장착하기위한 옵션을 제공 Adaptors는 Narishige에서도 사용할 수 있습니다. - 이식 피펫 준비
이식의 바늘은 위에서 설명한 본질적으로 만들어진, gastrula 단계 이식을위한 이상적인 바늘 구멍은 30-40밀리미터입니다. 보호막 형성 후, 뒤덮었 레이어 (EVL)는 어려운 이식 바늘은 배아에 침투에 대한 만들기, 더 자기편된다. 바늘 항목을 촉진하기 위하여, microforge를 사용하여 바늘의 끝 부분에 바브를 가져옵니다. 첫째, microforge의 필라멘트에 가까운 그것을 가져하여 바늘의 팁을 부드럽게, 다음 베벨의 최첨단이 필라멘트와 접촉을 할 수 있도록 바늘을 켜십시오. 바늘 연락처 필라멘트의 최첨단되면, 바브, 또는 작살을 만들 신속하게 거리를 가져옵니다. 손상 세포를 피하려면, 바브 바로되어야하며 바늘의 끝이 곡선 안됩니다 - 메틸 셀룰로오스에 이식 장착 배아
복합 현미경의 이식, 배아 매체에 녹아있는 메틸 셀룰로오스 (시그마)의 3 % 용액에 우울증 슬라이드에서 배아를 탑재합니다. 첫째, 얼룩 배아 매체의 풍부한 양의 후 유리 슬라이드 우울증, 홍수의 우울증에 메틸 셀룰로오스의 수직 줄무늬. 불타는 광택 pipet 사용하여 메틸 셀룰로오스의 한쪽에 우울증 슬라이드에서 EM의 표면 아래에 한 사람 거였어요 세 방패 무대 호스트를 전송할 수 있습니다. 호스트 (30~50% epiboly)보다 약간 젊은 아르 기증자의 배아를 선택합니다. gluing 모세관 튜브의 끝 부분에 2 파운드 테스트 낚싯줄의 짧은 길이의 끝을 만든 작은 루프로 부드럽게 메틸 셀룰로오스 스트립의 상단에 기증자와 호스트 배아를 말아서 메틸 셀룰로오스로 그들을 내려 물건 안전까지. 이식 세포가 호스트 배아가 제대로 위치 수 있도록지도 3,4와 방패를 기준으로 대상 조직의 위치가 중요 차폐 단계 운명의 특정 도메인 지식을 타겟으로하는 경우. 호스트 태아가 메틸 셀룰로오스로 배치로 이식하는 동안 바늘이 노른자를 손상하지 않고 기증자의 세포를 제공하기 위해 tangentially 배아를 입력하기 때문에, 그래서 타겟 지역이되는 최상의 위치에 그들을 롤. - 이식 세포
배아의 초점 비행기로 이동하여 이식의 바늘을 위치. 10X 목표를 사용하여 기증자의 배아에 먼저 중점을두고 있습니다. 다음에서 측면으로 배아를 이동하고, 초점 비행기를 조정하지 않고, 초점에 이식 바늘의 팁을 가져 micromanipulator의 컨트롤을 사용합니다. 슬라이드에 우울증의 가장자리가 허락하는 한 바늘이 수평에 가깝게되도록, 비교적 얕은 각도로 micropipette 홀더와 바늘 위치. 배아가 메틸 셀룰로오스에 제대로 장착되면 배가 바늘을 쉽게 통과할 수있는 너무 오래하지 않는 한 이식 바늘이 입력으로, 그것은 롤되지 않습니다. 뒤덮었 계층은 배아의 나이, 따라서 gastrula 단계 이식이 가장 오른쪽 보호막 형성 이후에 수행됩니다 강해질 것으로 보인다. 돔 무대 후, 노른자는 점차적으로 epiboly 진행으로 돼고 배반엽 캡의 세포 아래에 상주합니다. 노른자를 관통 방지하기 위해 바늘이 EVL보다 단지 약간 더 깊이있는 초점 비행기에서 배아를 입력해야합니다. 기증자의 배아에서 세포의 큰 숫자를 제거하면 바늘에 노른자를 빠는 실수 방지하기 위해, 전지가 차지하는되면서 주변의 바늘을 이동합니다. 한 기증자의 배아에서 세포가 여러 호스트에 이식하는 경우, 그것은 손상의 가능성을 최소화하기 위해 한 번만 바늘로 기증자를 입력하는 것이 좋습니다. 기증자 세포는 그로부터 3 호스트 태아에 원하는 위치까지 전송할 수 있습니다. 하나의 호스트 배아에 두 개 이상의 기증 배아에서 세포를 전송할 때, 호스트 배아에게 이식하기 전에 동일한 이식 바늘에 기증 배아의 각 세포를 받아하는 것이 좋습니다. 이것은 호스트 배아의 손상을 최소화하고, 세포가 자신의 행위가를 비교할 수 있도록, 배 (胚)의 같은 지역에 전송되는지 확인합니다. 거의 OC를 혼합장기 이식 바늘 내에 기증자 세포 사이 curs는 따라서 세포는 하나 이상의 기증자를 사용하는 단일 호스트로 전송해야합니다. 한 덩어리에서 세포를 입금 반대로 바늘이, 타겟 지역으로 그려지고있는 동안에는 기증자의 세포가 원하는 조직에 기여할 수있는 확률이 높아질하기 위해 기증자의 세포를 추방. 셀 전송이 완료되면, 펜 / Strep EM과 함께 신중하게 배양 접시와 홍수로 전체 슬라이드를 놓으십시오. 앞으로 몇 시간 동안 메틸 셀룰로오스는 배아를 풀어 분해합니다.
그림 1 : 키메라 배아를 만들기위한 현미경 설정. A : 해부 현미경 이식 장비는 마이크로 드라이브 (A) 3 방향 꼭지 (D)를 통해 석유 가득한 저수지 (B)와 이식 피펫 (C)에 연결되어있는 기름 가득 해밀턴 주사기로 구성되어 있습니다. 이식 피펫은 자기 발 (F)를 통해 금속베이스 플레이트 (표시되지 않음)에 첨부되어 거친 micromanipulator (E)에 장착됩니다. 이식은 최적의 광학에 대한 하단의 조명을 갖춘 stereomicroscope (G)의 무대에서 수행됩니다. B : 복합 현미경의 이식 장비는 비슷한 기름 가득 해밀턴 주사기와 마이크로 미터 드라이브 (A, B)로 구성되어 있지만이 경우에는 장기 이식 피펫은 누구의 X, Y 및 Z의 움직임을 제어할 수 피펫 홀더 (C)에 탑재 중 굵은 (D) 또는 고급 (E) micromanipulator에 의해. 이 예제에서는 micromanipulator가 고정 단계 현미경의 본문에 탑재, 그러나 그것은 일반 현미경의 무대에 마운트하는 것도 가능합니다. 우울증 슬라이드에 메틸 셀룰로오스에 고정화되는 배아는, 10X 목적 (F)을 사용하여 시각입니다. C : stereomicroscope 이식을위한 배아를 immobilizing에 대한 이식 금형. Dechorionated 배아는 90mm 페트리 접시에 아가로 오스에이 금형을 주조하여 만든 우물에 개별적으로 삭제됩니다. 우물의 크기가 표시됩니다.
그림 2 : gastrula 단계 이식을위한 배아를 장착. A : gastrula 이식 피펫의 이상적인 형태. 날카로운 팁과 베벨은 배아를 관통의 AIDS. B : 메틸 셀룰로오스의 기증자와 호스트 배아를 Immobilizing. 메틸 셀룰로오스의 스트립은 우울증 슬라이드의 우물에 드러 누우 셨다가 배아 매체의 풍부한 양의 홍수입니다. 배아는 배아 매체에 추가하고 작은 루프 (C)를 사용하여 메틸 셀룰로오스에 굴러 있습니다. 그림 배아의 DG 확대. 1B. D :이 단계에서 세포가 계속 커밋되므로 기증자의 배아는 피펫에 대한 쉬운 액세스를 허용하는 방향입니다. 예 : 쉴드 단계 호스트 배아는 대상 영역이 맨 위에되도록 지향하고 있습니다. 박스 지역에 이식 세포는 왼쪽 (E)과 오른쪽 (G) 양쪽 또는 복부 hindbrain 및 척수 (F)로 파생 등의 hindbrain 및 두개골 신경 능선에 기여하는 것입니다.
그림 3 : 키메라 배아 대표 이미지.
왼쪽 앞쪽에 등의보기에 표시되는 실드 단계에서 이식에 의해 생성 (AC) 18hpf 키메라 배아. (A, B) 키메라 배아의 분석에 의해 밝혀 세포 표면 수용체 EphA4에 대한 기능을 정렬. 왼쪽 패널 : 특정 hindbrain 세그먼트 (녹색)로 표시 rhodamine - 라벨 (rhod.) 공여 세포 (적색)와 유전자 변형 GFP의 병합. (A) WT 세포는 제어 키메라 배아의 전체 hindbrain에 기여. (B) EphA4 - 고갈 기증자 세포는 WT 호스트의 hindbrain의 특정 세그먼트에서 제외됩니다. (C) 기증자의 세포가 방패 단계 이식에 신경 튜브의 다른 부분을 타겟으로. EfnB2a의 forebrain를 표시 항체, 중반 hindbrain 경계와 중간 세그먼트와 카운터 묻은 WT 호스트의 forebrain / midbrain (왼쪽 패널) 또는 hindbrain / 척수 (오른쪽 패널)을 타겟으로 공여 세포 (적색) hindbrain (녹색). 스케일 바 : 50μm.
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Discussion
이식이 타겟 chimeras를 생산하는 데 사용할 수있는 용이성은 척추 모델로 zebrafish의 위대한 능력 중의 하나입니다. 위에서 설명하지 않은이 프로토콜의 수정 접합자의 개발에 필수적인 역할과 함께 유전자에 대한 모성 유전자 기능의 분석을 수 있습니다. 이러한 돌연변이 물고기가 성인까지 생존 수 있기 때문에 돌연변이 세포의 'germline의 클론 "을 작성, 기타 야생 형 호스트 배아에 돌연변이 germline을 전송하는 것이 필요합니다. 생성 germline 모자이크는 야생 형 호스트 배아에 돌연변이 기증자로부터 이식 원시 배아 세포를 포함한다. 배아에있는 다른 모든 세포 lineages 달리 배아 세포 계보 (Lineage)는 산모 determinants 5,6의 상속에 의해 초기 개발에 지정됩니다. 따라서 germline의 모자이크 만들기의 첫 번째 도전은 기증자의 배아에 원시 배아 세포 (PGCs)를 식별합니다. midblastula 단계에서 PGCs 그렇게 혈통 - 표시 기증 배아의 여백 50-100 임의의 세포를 채취, 여백 7,8 함께 거주하고 자주 PGCs의 전송 결과. 레이블이 지정되지 않은 호스트 배아의 동물 극으로 전달하면 원시 배아 세포는 적극적으로 그들이 unambiguously 자신의 특성 위치, 대형, 그들의 느린 proliferative 속도로 인해 염료 보존에 의해 개발의 24 시간 확인할 수있는 추정 생식선으로 마이 그 레이션 9-11. 그들이 blastula 동물 극에 이식한다면 주로 forebrain과 눈 : 한편, 비 PGCs는 호스트의 위치에 의해 결정 운명을 습득합니다 기증자 - 파생. 데드 엔드 유전자를 허물고 morpholinos와 호스트의 배아를 주입하는 것이 효과적 그래서, 셀 자율적인 방식으로 호스트 germline을 제거까지만해도 하나의 기증자 파생 PGC는 전체 germline 10,12 (CM, 개인 관찰)을 repopulate 수 있습니다. 최근 PGCs가 blastula 단계 동안 라이브 배아에서 시각 될 수있는 유전자 변형 라인은 13 개발되었습니다. 단일 PGCs가 확인하고 germline - 고갈 호스트로 이식 수 있기 때문에 누구의 모성 기능을 결정하는 돌연변이로 넘어 때, 데드 엔드 morpholinos와 결합이 transgene은 germline 이식 손쉬운하겠습니다.
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Acknowledgments
이 문서의 작성 중에 도움이 입력을위한 Moens 연구실의 구성원 감사합니다. HK는 NIH / NICHD 부여 # 5R01HD037909 - 08에 의해 지원 박사후 사람입니다. CBM은 하워드 휴즈 의학 연구소와 수사관이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately |
| Pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | protease type XIV” |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4458 | 100x stock |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M-0387 | |
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes, Life Technologies | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter Instrument Co. | BF120-94-10 | |
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | |
| Transplant pipette option 2 | VWR international | #53508-400 | |
| micromanipulator | Narishige International | UMJ-3FC (?) | |
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige International | GJ-1 | |
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | |
| Fine micromanipulator | Narishige International | MMO-203 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | 12560A | |
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. | ||
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose. |
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References
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- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
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