Summary
胞胚や原腸胚の段階で移植の対象となるキメラゼブラフィッシュの胚を生成するためのステップバイステップのガイド。
Abstract
複雑な発達過程を把握するために使用される最も強力なツールの一つは、キメラ胚の解析です。キメラは、複数の動物からの細胞を含む生物として定義され、モザイクには、複数の遺伝子型の細胞は通常、野生型と変異体、混合されているキメラの一種です。ゼブラフィッシュでは、キメラが容易に適切な初期段階での宿主胚にドナー胚からの細胞の移植によって作製することができる。標識されたドナーの細胞は、1細胞期胚に蛍光色素などの系列のマーカー、、の注入によって生成されます。標識されたドナー細胞は、ドナー胚から取り出され、化合物または解剖顕微鏡のどちらかに取り付けられたオイル制御のガラスピペットを使用して、ラベルなしホスト胚に導入されています。ドナー細胞は、いくつかのケースでは定評のある運命のマップに基づいて、ホスト胚の移植部位を選択することで、開発胞胚や原腸胚段階のホスト胚の特定の地域や組織をターゲットとすることができます。
Protocol
胞胚や原腸胚の段階で移植の対象となるキメラゼブラフィッシュの胚を生成するためのステップバイステップのガイド。
複雑な発達過程を把握するために使用される最も強力なツールの一つは、キメラ胚の解析です。キメラは、複数の動物からの細胞を含む生物として定義され、モザイクには、複数の遺伝子型の細胞は通常、野生型と変異体、混合されているキメラの一種です。ゼブラフィッシュでは、キメラが容易に適切な初期段階での宿主胚にドナー胚からの細胞の移植によって作製することができる。標識されたドナーの細胞は、1細胞期胚に蛍光色素などの系列のマーカー、、の注入によって生成されます。標識されたドナー細胞は、ドナー胚から取り出され、化合物または解剖顕微鏡のどちらかに取り付けられたオイル制御のガラスピペットを使用して、ラベルなしホスト胚に導入されています。ドナー細胞は、いくつかのケースでは定評のある運命のマップに基づいて、ホスト胚の移植部位を選択することで、開発胞胚や原腸胚段階のホスト胚の特定の地域や組織をターゲットとすることができます。
パート1：1細胞期でゼブラフィッシュ胚を注入する。
- 1細胞期胚の酵素dechorionation。
ゼブラフィッシュブック1に記載したようには0.5 mg / mlのプロナーゼ溶液中で〜1-5"を1細胞期でインキュベートしてタンパク質分解dechorionate胚、へ。ペン/咽頭1としてすぐにchorionsが目に見えて崩壊し始めるようにと胚の培地中のMoniterの密接dechorionationと水没胚（EM）。一度彼らのchorionsから放出、胞胚と原腸胚期胚は壊れやすく、プラスチックに付着または空気にさらされる場合崩壊します。したがって、ペン/咽頭EMで水没dechorionated胚を保持ワイドボアファイアーポリッシュガラスピペットを用いて皿の間の転送、および寒天でコーティングされたプラスチック製の皿（ペン/咽頭EMでは1.2％アガロース）またはオートクレーブガラスペトリ皿のどちらかで維持する。 - 系統マーカーでdechorionated胚を注入する。
アガロースは、ペンで行った/ EMを連鎖球菌1.2％の4分の3のペトリ皿の最も広い部分の45度の角度でスライドガラスを挿入して注入皿を準備します。アガロースの凝固後のスライドの除去は、ベベル谷を残します。ペン/咽頭EMで満たされた注射皿の溝にdechorionated胚を移す。正確に較正された火災引っ張らガラスのインジェクションピペットととしてゼブラフィッシュブック1に記載の圧力注入のリグを使用して、系統マーカーの1nlボリュームを注入する。と4セルの段階 - 直接1の間のdechorionated胚の卵黄に色素と低分子系統のトレーサーを注入する。蛍光デキストランの3％溶液は、開発の数日間を通してキメラ胚におけるドナー由来細胞の検出を可能にする十分です。系統のマーカーは、蛍光タンパク質（例えば、GFPまたはRFP）をコードするmRNAの場合は、初期の1細胞期の胚の細胞に直接注入する。 - 系統マーカーと非dechorionated胚を注入する。
絨毛膜の直径とほぼ同じ幅の井戸を持つ金型の周りにEMで1.2％アガロースを固化して、マルチウエル注入の料理を準備します。マルチウェル注入皿ペン/咽頭EMで半分はに非dechorionated胚を移す。余分な水分を取り除きます。前述のようにこのように固定化、胚は系統マーカーの1nl量を注入することができます。 - 移植のために注入された胚を上げる。
新鮮なペンで低密度（皿40-50胚）で胚を上げる/ EMを連鎖球菌。かなり密接に移植に使用されるドナーとホスト胚のステージと一致。注入された胚はわずかに遅延させる傾向があることに注意し、シールドの段階移植、ドナーはわずかにホスト遅れにするための目的のため。彼らの開発をずらすと移植を行うことができますする時間ウィンドウを最大化するために、異なる温度、25 ° C、28 ° C、および31 ° Cで胚をインキュベートする。
第2部：移植によるキメラゼブラフィッシュの胚を作る。
- 実体顕微鏡で胞胚の段階で移植
- 胞胚のための移植のリグの説明
ゼブラフィッシュ胞胚の細胞移植に用いる装置は、フレキシブルチューブの長さによって鉱物油のタンクにし、マイクロピペットホルダーに三方活栓が接続されているマイクロドライブ制御のハミルトンシリンジ（10 L - 50 L）で構成されています。移植のリグを組み立て後、それをシステムからすべての気泡を除去するために注意しながら、鉱物油で満たされている。気泡の存在は否定的に目を制御する能力に影響を与えます電子吸引と圧力。かなりの高倍率と良い光学系（理想的には少なくとも80倍の倍率）と実体顕微鏡を使用してください。マイクロピペットホルダーと針の位置は、注射用として、ナリシゲの手動マイクロマニピュレーターによって制御することができますが、ステレオスコープのベースは、その後、マイクロマニピュレータとの容易なアクセスを可能にするのボディに取り付けるアダプター広すぎる場合実体顕微鏡は、ナリシゲから購入することができます。マニピュレータのマウントは、移植の針に振動を転送を避けるために、非常に安定していなければなりません。マグネットベースは、この目的に適しています。 - 移植ピペットの準備
移植の針は、電極の引き手で穏やかなテーパーに描かれているガラスキャピラリーピペット（試薬のテーブルの下に2つのオプションを参照）から作られています。針の内径が移植される細胞よりも僅かに大きい点で、ストレートエッジの黒人を使って解剖顕微鏡下で針からの先端を破る。ジャギーエッジの無い、ベベルを作成し、可能な限りスムーズにブレークを作るためにわずかな角度で黒人を保持する。胞胚期移植のために針の外径は約50〜60ミリメートルを測定する必要があります。 - 寒天金型の移植用取付胚
EMで溶融1.2％アガロースで半分満たされているペトリ皿にくさび状の突起の行を持つプラスチック金型をフロートさせることによって注射の料理を準備します。アガロースが固化した後、一胚を保持するのに十分な各ちょうど大三角形状の井戸の行が含まれている寒天の金型を残して、テンプレートを削除します。ペン/咽頭EMと移植の金型を記入し、ドナー胚が1つの列を下に配置され、宿主胚は、隣接する列を下に配置されるように火災研磨したガラスピペットで各ウェルに個別に胞胚期の胚をロードする。 - 移植細胞
その両側に移植井戸の位置は、胚、そうでない穿刺卵黄に注意しながら、などの移植時に必要な移植ピペットで再配置。ステージ上の位置皿になるように移植の針が胎児に入ると、針はそのほかの背面壁に胚をプッシュします。マイクロマニピュレータを使用して、かなり急な角度で皿に移植針を下げる。理想的には移植の針は約45度の角度で胚を入力する必要があります。針の先端が下胚の培地の表面になると、ハミルトンシリンジを制御するマイクロドライブをねじることによって針に胚の培地の少量を描く。もっとも的確な制御を、鉱物油と胚の媒質との間のインタフェースは、針の薄い、テーパ部に残るはずですが、あまりにも終わりに近いではない。そっと針をドナー胚を置き、その後戻って針を描画し、所望の位置に胚の胞胚キャップを入力します。迅速、ハードヒットは、それがロールバックさせることなく胚が浸透する。針にゆっくりと慎重にドナー細胞を描く。細胞が短すぎるためにとられている場合、彼らは、せん断に可能性があります。また、鉱物油と結合するので、針に卵黄を服用を避ける、その後、細胞を殺すとなる。希望のセル数が取り上げされた後、吸引を停止し、胚から針を除去するために少しプレッシャーを逆に。移植の皿を移動して所定の位置に、ホスト胚をもたらす。ホスト胚の位置に微調整を穏やかに卵黄を触れないようにしてように注意されている限り移植の針を、使用してそれを回すことによって行うことができます。宿主胚にドナー細胞を追放したとき、これは開発を妨害しまたは胚を殺すことができるように、胚の培地または鉱物油を大量に導入することは避けてください。動物 - 植物軸に沿った細胞の位置は、三胚葉、内胚葉、中胚葉、および外胚葉2,3のいずれかに彼らの貢献に影響を与えます。動物極に向かって移植した細胞が外胚葉の運命、最も一般的に表面の外胚葉、前脳と眼に貢献する一方したがって、前の原腸陥入の先頭に近いマージンに移植された細胞は、内胚葉と中胚葉に優先的に上昇を与える。したがって、組織ターゲティングの度合いは、胞胚の段階でも行うことができます。セルの転送が完了したら、さらに開発するために24ウェルプレートの寒天被覆ウェルにドナー - ホストのペアを転送する。
- 複合顕微鏡での原腸胚段階での移植
- 移植のリグの説明
セルの転送は、油圧三軸油で提供される針の位置を精密に制御から複合顕微鏡の利点を行うマイクロマニピュレータ。ピペットで吸引が胞胚移植のために使用されるものと同様のマイクロドライブハミルトンシリンジによって制御されている間、このマニピュレータでは、移植ピペットの微細な動きを制御します。固定ステージで直立化合物の顕微鏡は、このような顕微鏡を中心に以来、セルの転送を実行するために胚をピペットに相対移動させることはありません望ましい。しかし、調整可能なステージ化合物の顕微鏡を使用する必要がある場合、その後マイクロマニピュレータは同じ効果でステージにではなく、顕微鏡のボディに取り付けることができます。様々なメーカーからの複合顕微鏡のステージまたは本体のどちらかにマイクロマニピュレーターを取り付けるためのオプションを提供するアダプタは、ナリシゲからも利用できます。 - 移植ピペットの準備
前述のように移植の針は本質的に見直され、原腸期の移植のために理想的な針の開口部は30〜40 mmです。シールドの形成後、包み込む層（EVL）は難しい移植の針が胎児に侵入するための意思、より多くの付着になります。針のエントリを容易にするために、マイクロフォージを使用して針の先端に突起を引っ張る。最初に、マイクロフォージのフィラメントに近いそれを導入することによって、針の先端を平滑化し、ベベルの先端がフィラメントに接触することができるように針を回します。針の接触フィラメントの先端したら、バーブ、または銛を作成するために迅速に離れてそれを引っ張る。損傷細胞を避けるため、バーブはまっすぐでなければならず、針の先端は曲線ではないすべき - メチルセルロースの移植用取付胚
複合顕微鏡の移植の場合、胚の培地に溶解したメチルセルロースの3％溶液（シグマ）でうつ病のスライドに胚をマウント。その後、最初に、塗抹ガラスのうつ病のスライドのうつ病におけるメチルセルロースの縦ストライプ、胚の培地の寛大な量で洪水。ファイアーポリッシュピペットを用いて、メチルセルロースの片側にうつ病のスライド上でEMの表面の下に1つのドナー三シールド段階のホストを転送する。ホスト（被包30から50パーセント）よりも若干年齢が若いドナー胚を選択してください。 2ポンドテスト釣行の短い長さの両端キャピラリーチューブの端に接着することによって作られた小さなループで、優しくメチルセルロースストリップの上部にドナーと宿主胚をロールアップし、メチルセルロースにそれらを詰め込む固定されるまで。移植された細胞は、特定のドメインをターゲットにする場合は、シールドのステージの運命地図3,4とシールドの相対標的組織の位置の知識は、宿主胚を正しく配置できるようにするために不可欠です。宿主胚をメチルセルロースに配置されるように移植中に針が卵黄を損傷することなくドナー細胞を提供するために接線方向に胚を入力するので、したがって、対象となる地域があることを最上位置にそれらをロールバックします。 - 移植細胞
胚の焦点面にそれを移動することで、移植針を合わせます。 10倍対物レンズを用いてドナー胚の最初の焦点。その後、オフ側に胚を移動し、焦点面を調整することなく、焦点に移植針の先端を持ってマニピュレータのコントロールを使用してください。スライド上のうつ病のエッジが許す限り針が水平に近くなるように、かなり浅い角度でマイクロピペットホルダーと針を合わせます。胚をメチルセルロースで適切にマウントされている場合、移植の針が入るときに胚が針が容易に浸透できるようにするには古すぎる場合を除き、それは、ロールバックしません。包み込む層は、従って、原腸期の移植が最良の右のシールドを形成した後に実行される、胚の年齢として強くするためだ。ドームのステージの後、卵黄は徐々に被包が進むにつれて薄く胚盤葉の帽子、のセルのすぐ下に常駐します。卵黄にピアスを避けるために、針はEVLのそれよりもわずかに深い焦点面で胚を入力する必要があります。ドナー胚から細胞を大量に削除する際に、針に卵黄を吸って誤って避けるために、細胞が取り込まれるように周りに針を動かす。 1つのドナー胚からの細胞が複数のホストに移植する場合は、それが損傷の可能性を最小限にするために一度だけ針でドナーを入力するのが最適です。ドナー細胞は、その後3つのホスト胚には、目的の場所まで転送することができます。つのホスト胚に2つ以上のドナー胚から細胞を転送する場合、それは、ホスト胚にそれらを移植前にドナー胚のそれぞれから同じ移植針に細胞を取るのがベストです。これは、ホスト胚の損傷を最小限に抑え、細胞がその動作を比較できるように、胚の同じ領域に転送されます。ほとんど混合OC移植針内ドナー細胞間CURSは、従って、細胞は複数のドナーが使用されている単一のホストに転送する必要があります。単一の塊に細胞を付着させるとは対照的に、針が、対象地域によって描かれている間ドナーの細胞が、所望の組織に貢献する可能性を増加させるために、ドナー細胞を排出する。セルの転送が完了すると、ペン/咽頭EMで慎重にペトリ皿と洪水にスライド全体を置きます。次の数時間にわたってメチルセルロースは、胚を放出、溶解します。
図1：キメラ胚を作るための顕微鏡のセットアップ。 ：解剖顕微鏡の移植のリグは、3方コック（D）を経由して油で満たされたタンク（B）と移植ピペット（C）に接続されているマイクロドライブ（）とオイル充填ハミルトンシリンジで構成されています。移植ピペットは、磁気フィート（F）を介して金属ベース板（図示せず）に接続されている粗マイクロマニピュレータ（E）にマウントされています。移植は、最適な光学系の底部照明設備付きの実体顕微鏡（g）の舞台で上演されています。 B：複合顕微鏡の移植のリグは、類似の油入ハミルトンシリンジとマイクロドライブ（A、B）で構成されていますが、この場合には移植のピペットは、そのX、YおよびZの動きを制御することができるピペットホルダー（C）にマウントされています（d）の粗調整または微（e）のマニピュレータのいずれかによって。この例では、マニピュレータを固定ステージ顕微鏡のボディにマウントされている、しかしそれは、通常の顕微鏡のステージ上にマウントすることも可能です。うつ病のスライド上メチルセルロースに固定化されている胚は、、10倍の目標（f）を用いて可視化されています。 C：実体顕微鏡の移植のために胚を固定化するための移植型。 Dechorionated胚は90ミリメートルシャーレにアガロースにこの金型をキャストすることによって作られた井戸に個別にドロップされます。井戸の寸法は示されています。
図2：原腸胚段階の移植のために胚をマウント。 ：原腸胚移植ピペットの理想的な形状。鋭い先端を持つベベルは、胚を貫通にも役立ちます。 B：メチルセルロースでドナーとホスト胚を固定化する。メチルセルロースのストリップは、うつ病のスライドのほかに敷設し、胚の培地の寛大な量でフラッディングされます。胚は、胚の培地に添加されており、小さなループ（C）を使用してメチルセルロースにロールバックされます。図中の胚のDGの拡大。 1B。 D：この段階では細胞がまだコミットされていないので、ドナー胚は、ピペットのための最も簡単なアクセスを可能にする指向です。 EG：シールド段階の宿主胚には、対象地域が最上位になるように配向される。箱入りの領域に移植された細胞は、左（E）と右（G）の側面からまたは腹側後脳と脊髄（F）に由来する背後脳と頭蓋神経冠に貢献していきます。
図3：キメラ胚の代表画像。
（AC）シールドの段階で移植によって生成された18hpfキメラ胚は、左前方、背側のビューで表示。 （A、B）キメラ胚の解析によって明らかに細胞表面の受容体EphA4のための関数をソートする。左のパネル：ローダミン標識（rhod.）ドナー細胞（赤）と、特定の後脳のセグメント（緑）で発現するトランスジェニックGFPのマージ。 （A）WT細胞はコントロールキメラ胚の全体後脳に寄与する。 （B）EphA4の枯渇ドナー細胞は、WTホストの後脳内の特定のセグメントから除外されます。 （C）ドナー細胞は、シールド段階移植における神経管の異なる部分を対象。前脳をマークEfnB2a抗体との対比染色WTホストの前脳/中脳（左パネル）または後脳/脊髄（右パネル）を対象としたドナー細胞（赤）、半ば後脳の境界との中間のセグメント後脳（緑）。スケールバー：50μmの。
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Discussion
移植を対象とキメラを生成するために使用することができる容易さは、脊椎動物のモデルとしてゼブラフィッシュの列強の一つです。上記以外のこのプロトコルの変更は、接合体の開発において重要な役割を持つ遺伝子の母性遺伝子機能の解析が可能になります。これらの変異体の魚が大人になるまで生き残ることができないので、それは変異細胞の"生殖クローン"を作成し、そうでなければ、野生型宿主胚に変異生殖細胞を転送する必要があります。生殖細胞モザイクを生成すると、変異体ドナーからの野生型宿主胚に移植始原生殖細胞を含む。胚内の他のすべての細胞系譜とは異なり、生殖細胞系列は、母親の決定要因5,6の継承により、非常に開発の初期段階で指定されています。このように、生殖細胞モザイクを作るの最初のチャレンジは、ドナー胚の始原生殖細胞（始原生殖細胞）を識別している。中期胞胚段階で始原生殖細胞は、その系統標識ドナー胚の縁から50から100までのランダムな細胞を拾い、マージン7,8に沿って存在し、頻繁に始原生殖細胞の移動をもたらす。ラベルなしホストの胚の動物極に転送するときに、始原生殖細胞は、積極的に彼らは明確にそれらの特徴の位置、大きいサイズ、およびそれらの遅い増殖速度による色素保持することで、開発の24時間で同定することができると推定される生殖腺に向かって移行9-11主に前脳と眼それらは胞胚の動物極に移植した場合：一方、ドナー由来の非始原生殖細胞は、宿主内の位置によって決定される運命を取得します。 デッドエンドの遺伝子をノックダウンするモルフォとホスト胚に注入すると、事実そう、細胞自律的な方法でホストの生殖細胞を排除することであっても、単一ドナー由来のPGCは、全体の生殖系列10,12（CM、個人的な観察 を）再作成することもできます。最近では、始原生殖細胞は胞胚段階でライブ胚で視覚化することができるトランスジェニック系統は、13を開発しました。単一の始原生殖細胞を同定し、生殖細胞枯渇宿主に移植することができるので、その母体の機能が決定される変異型に交差するとき、 デッドエンドのモルフォと組み合わせてこの導入遺伝子は、生殖細胞移植が容易なようになります。
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Acknowledgments
この記事の執筆中に役立つ、入力用Moensラボのメンバーに感謝します。 HKは、NIH / NICHD助成金＃5R01HD037909 - 08でサポートされているポスドク研究員です。 CBMは、ハワードヒューズ医学研究所との研究者でもある。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately |
| Pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | protease type XIV” |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4458 | 100x stock |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M-0387 | |
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes, Life Technologies | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter Instrument Co. | BF120-94-10 | |
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | |
| Transplant pipette option 2 | VWR international | #53508-400 | |
| micromanipulator | Narishige International | UMJ-3FC (?) | |
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige International | GJ-1 | |
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | |
| Fine micromanipulator | Narishige International | MMO-203 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | 12560A | |
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. | ||
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose. |
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References
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- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
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