Summary
Een stap-voor-stap handleiding voor gerichte chimerisch zebravis embryo's genereren door transplantatie op de blastula of gastrulastadium.
Abstract
Een van de meest krachtige tools gebruikt worden om inzicht te krijgen in complexe ontwikkelingsprocessen is de analyse van chimeer embryo's. Een chimera is gedefinieerd als een organisme dat cellen van meer dan een dier bevat; mozaïeken zijn een soort van chimera waarbij cellen van meer dan een genotype worden gemengd, meestal wild-type en mutant. In de zebravis, kan chimeren gemakkelijk worden gemaakt door transplantatie van cellen van een donor embryo in een gastheer embryo op het juiste embryonale stadium. Gelabelde donor cellen worden gegenereerd door injectie van een geslacht marker, zoals een fluorescente kleurstof, in de een-cellig stadium embryo. Gelabelde donor cellen worden verwijderd uit donor embryo's en geïntroduceerd in ongelabelde gastheer embryo's met behulp van een olie-gecontroleerde glazen pipet gemonteerd op ofwel een verbinding of dissectiemicroscoop. Donor cellen kunnen in sommige gevallen worden gericht op een specifieke regio of weefsel van de zich ontwikkelende blastula of gastrulastadium gastheer embryo door te kiezen voor een transplantatie plaats in de ontvangende embryo op basis van gerenommeerde lot kaarten.
Protocol
Een stap-voor-stap handleiding voor gerichte chimerisch zebravis embryo's genereren door transplantatie op de blastula of gastrulastadium.
Een van de meest krachtige tools gebruikt worden om inzicht te krijgen in complexe ontwikkelingsprocessen is de analyse van chimeer embryo's. Een chimera is gedefinieerd als een organisme dat cellen van meer dan een dier bevat; mozaïeken zijn een soort van chimera waarbij cellen van meer dan een genotype worden gemengd, meestal wild-type en mutant. In de zebravis, kan chimeren gemakkelijk worden gemaakt door transplantatie van cellen van een donor embryo in een gastheer embryo op het juiste embryonale stadium. Gelabelde donor cellen worden gegenereerd door injectie van een geslacht marker, zoals een fluorescente kleurstof, in de een-cellig stadium embryo. Gelabelde donor cellen worden verwijderd uit donor embryo's en geïntroduceerd in ongelabelde gastheer embryo's met behulp van een olie-gecontroleerde glazen pipet gemonteerd op ofwel een verbinding of dissectiemicroscoop. Donor cellen kunnen in sommige gevallen worden gericht op een specifieke regio of weefsel van de zich ontwikkelende blastula of gastrulastadium gastheer embryo door te kiezen voor een transplantatie plaats in de ontvangende embryo op basis van gerenommeerde lot kaarten.
Deel 1: Het injecteren van zebravis embryo's in het een-cellig stadium.
- Enzymatische dechorionation van 1-cellig stadium embryo's.
Om proteolytisch dechorionate embryo's, incuberen bij de een-cellig stadium voor ~ 1-5 'in een 0,5 mg / ml pronase-oplossing, zoals beschreven in de zebravis Boek 1. Moniter dechorionation op de voet en onder te dompelen in embryo's Embryo Medium (EM) met Pen / Strep 1 zodra de chorions beginnen te zichtbaar instorten. Eenmaal bevrijd van hun chorions, blastula en gastrulastadium embryo's zijn kwetsbaar en zullen vasthouden aan plastic of desintegreren bij blootstelling aan lucht. Daarom houden dechorionated embryo's ondergedompeld in Pen / Strep EM, overdracht tussen gerechten met een groot kaliber brand-gepolijst glas pipet, en te onderhouden in een agar-coated plastic schaaltjes (1,2% agarose in Pen / Strep EM) of geautoclaveerd glazen petrischalen. - Injecteren dechorionated embryo's met afstamming marker.
Bereid een injectie gerecht door het invoegen van een glaasje op een hoek van 45 graden over het breedste deel van een petrischaal driekwart vol van 1,2% agarose gemaakt in Pen / Strep EM. Verwijdering van de schuif na agarose stolling laat een schuine trog. Overdracht dechorionated embryo's in de drinkbak van een injectie schotel vol met Pen / Strep EM. Injecteer 1nl volumes van afstamming marker met behulp van een nauwkeurig gekalibreerde brand-getrokken glas injectie pipet en een druk injectie rig, zoals beschreven in de zebravis Boek 1. Injecteren kleurstoffen en met een laag moleculair gewicht lineage tracers direct in de dooier van dechorionated embryo's tussen de 1 - en 4-cell fasen. Een 3%-oplossing van TL-dextran is voldoende om voor de detectie van donor-afgeleide cellen in chimère embryo's door middel van een aantal dagen van ontwikkeling. Wanneer de afstamming marker is een mRNA dat codeert voor een fluorescerend eiwit (bijvoorbeeld GFP of RFP), direct te injecteren in de cel van de eerste een-cellig stadium embryo. - Het injecteren van niet-dechorionated embryo's met afstamming marker.
Bereid multi-injectie goed gerechten door het harden van 1,2% agarose in EM rond een mal met putten ongeveer dezelfde breedte als de chorion diameter. Overdracht niet-dechorionated embryo's in een multi-well injectie schotel half gevuld met Pen / Strep EM. Verwijder overtollige vloeistof. Zo geïmmobiliseerd, kunnen embryo's worden geïnjecteerd met 1nl volumes van afstamming marker zoals hierboven beschreven. - Het verhogen van geïnjecteerde embryo's voor transplantatie.
Te verhogen embryo's bij een lage dichtheid (40-50 embryo's per gerecht) in vers Pen / Strep EM. Stage-match van de donor en gastheer embryo's worden gebruikt voor transplantatie vrij nauw. Voor schild stadium transplantaties, doel voor de donoren om iets achter bij de gastheren, er rekening mee dat geïnjecteerde embryo's hebben de neiging om enigszins vertraagd. Incubeer embryo's bij verschillende temperaturen, 25 ° C, 28 ° C en 31 ° C, hun ontwikkeling wankelen en het tijdvenster waarover transplantaties kunnen worden uitgevoerd maximaliseren.
Deel 2: Het maken van chimere zebravis embryo's door de transplantatie.
- Transplantatie op blastula stadia op de stereomicroscoop
- Beschrijving van de transplantatie rig voor de blastula
Het apparaat gebruikt voor cel transplantatie bij de zebravis blastula bestaat uit een micrometer drive-gestuurde spuit Hamilton (10 l-50 l) bevestigd door een drie-weg kraan op een reservoir van minerale olie en een micropipet houder door middel van een lengte van flexibele buizen . Na het monteren van de transplantatie rig, is gevuld met minerale olie, zorg ervoor dat alle luchtbellen te verwijderen uit het systeem. De aanwezigheid van een luchtbel een negatieve invloed op uw vermogen om te e-controlee zuig-en druk. Gebruik een stereomicroscoop met vrij hoge vergroting en een goede optiek (bij voorkeur minimaal 80x vergroting). De positionering van de micropipet houder en naald kan worden gecontroleerd door een Narishige handleiding micromanipulator, als voor injecties, maar als de basis van de stereoscoop is te groot om gemakkelijk met de micromanipulator, dan is een adapter die hecht aan het lichaam van de stereomicroscoop kunnen ook worden gekocht Narishige. De montage van de micromanipulator moet zeer stabiel zijn om te voorkomen de overdracht van trillingen naar de transplantatie naald, een magnetische basis werkt goed voor dit doel. - De voorbereiding van de transplantatie pipet
Transplantatie naalden zijn gemaakt van glas capillair pipetten (zie twee opties in reagentia tabel hieronder) die worden aangetrokken door een zacht taper op een elektrode trekker. Breek het uiteinde van de naald af onder een dissectiemicroscoop met behulp van een rechte rand scheermes op het punt waar de binnendiameter van de naald is iets groter dan de cellen worden getransplanteerd. Houd het scheermes in een lichte hoek naar een schuine rand te creëren en maak de breuk zo soepel mogelijk, zonder gekartelde randen. Voor de blastula stadium transplantaties de buitenste diameter van de naald moet zijn ongeveer 50-60 mm. - Montage van embryo's voor transplantatie in agar mallen
Bereid injectie gerechten door drijvende een plastic mal met rijen wigvormige uitsteeksels in een petrischaaltje dat is half gevuld met gesmolten 1,2% agarose in EM. Nadat de agarose gestold is, verwijdert u de sjabloon, zodat een agar schimmel die rijen van driehoekig gevormde putten elk net groot genoeg om een embryo te houden bevat. Vul de transplantatie mal met Pen / Strep EM en individueel belasting blastula stadium embryo's in elk putje met een open geslepen glazen pipet, zodat de donor embryo's worden naar beneden een kolom en de gastheer embryo's worden geplaatst beneden de aangrenzende kolom. - Transplanteren cellen
Positie van embryo's in de transplantatie putten op hun zijden herpositioneren met de transplantatie pipet zo nodig tijdens de transplantatie en zorg ervoor dat de dooier doorprikken. Plaats de schotel op het podium, zodat wanneer de transplantatie naald een embryo komt, de naald duwt de embryo tegen de achterwand van het goed. Met behulp van de micromanipulator, hoe lager de transplantatie naald in de schotel op een vrij steile hoek. Idealiter zou de transplantatie naald moet u het embryo ongeveer een hoek van 45 graden. Zodra de punt van de naald is onder het oppervlak van het embryo medium, trek je een kleine hoeveelheid embryo medium in de naald door twisten van de micrometer rijden regelen van de Hamilton spuit. Voor de meest precieze controle, moet de interface tussen de minerale olie en het embryo medium blijven in de dunne, taps toelopende deel van de naald, maar niet te dicht bij het einde. Voorzichtig de positie van de donor embryo met de naald en dan terug te trekken van de naald en voer de blastula dop van het embryo op de gewenste positie. Een snelle, hard geraakt zal doordringen het embryo, zonder dat het te rollen. Het opstellen van donor cellen langzaam en voorzichtig in de naald. Als de cellen worden opgenomen te snel, ze waarschijnlijk afschuiving. Ook voorkomen dat u dooier tot in de naald, want het zal binden aan de minerale olie, die vervolgens zal doden de cellen. Nadat het gewenste aantal cellen wordt in beslag genomen, iets achteruit de druk om de zuig-stop en verwijder de naald uit de embryo. Breng de host embryo in positie door het verplaatsen van de transplantatie schotel. Kleine aanpassingen aan de positie van de gastheer embryo kan worden gemaakt door voorzichtig te draaien met behulp van de transplantatie naald, zolang zorg is genomen om niet aan de dooier. Wanneer het verdrijven van de donor cellen in de gastheer embryo, voorkomen dat er een grote hoeveelheid embryo medium of een minerale olie, omdat dit zou kunnen interfereren met de ontwikkeling of doden de embryo. De positie van de cellen langs de dier-plantaardige as invloeden van hun bijdrage aan een van de drie kiembladen, endoderm, mesoderm, ectoderm en 2,3. Bijgevolg zal cellen dicht bij de marge getransplanteerde voorafgaand aan het begin van de gastrulatie aanleiding geven voorkeur aan endoderm en mesoderm, terwijl cellen getransplanteerd in de richting van het dier pool zal bijdragen aan ectodermale lot, meestal oppervlakte ectoderm, voorhersenen en ogen. Dus een zekere mate van weefsel targeting kan zelfs worden bereikt op blastula stadium. Nadat de cel transfers zijn afgerond, de overdracht van de donor-host paren om de agar gecoate wells van een 24 wells plaat verder te ontwikkelen.
- Transplantatie op gastrula stadia op de samengestelde microscoop
- Beschrijving van de transplantatie rig
Cel transfers uitgevoerd op een samengestelde microscoop profiteren van de precieze controle van de positie van de naald door een drie-assige hydraulische oliemicromanipulator. Dit micromanipulator regelt de fijne bewegingen van de transplantatie pipet, terwijl de zuigkracht in de pipet wordt gecontroleerd door een micrometer-drive Hamilton spuit vergelijkbaar met die gebruikt voor blastula transplantaties. Een rechtopstaande samengestelde microscoop met een vaste trap is de voorkeur voor het uitvoeren van transfers cel, omdat een dergelijke focus een microscoop niet ertoe leiden dat de embryo te verplaatsen ten opzichte van de pipet. Echter, als een verstelbare-stage samengestelde microscoop moet worden gebruikt, dan is de micromanipulator gemonteerd kan worden op het podium in plaats van het lichaam van de microscoop met hetzelfde effect. Adapters dat de opties voor het monteren van de micromanipulator naar het podium of het lichaam van samengestelde microscopen, hetzij van verschillende fabrikanten zijn ook verkrijgbaar bij Narishige. - De voorbereiding van de transplantatie pipet
Transplantatie naalden zijn gemaakt in essentie zoals hierboven beschreven, want gastrulastadium transplantaties het ideale naald opening is 30-40 mm. Na het schild formatie, de omhullende laag (EVL) wordt meer aanhanger, waardoor het moeilijk is voor de transplantatie naald naar de embryo doordringen. Ter bevordering van de naald entry, trek een weerhaak aan het uiteinde van de naald met behulp van een microforge. De eerste, glad de punt van de naald door te brengen te sluiten bij de gloeidraad van de microforge; dan zo draai de naald, dat de voorste rand van de schuine kant kan contact maken met de gloeidraad. Zodra de voorste rand van de naald contact op met de gloeidraad, trek het snel weg naar een weerhaak, of een harpoen te creëren. Om te voorkomen dat cellen beschadigen, dient de weerhaak recht en de punt van de naald moet niet curve - Montage van embryo's voor transplantatie in methylcellulose
Voor de samengestelde microscoop transplantaties, monteren embryo's op een depressie dia in een 3% oplossing van methylcellulose (Sigma) opgelost in embryo medium. Eerste uitstrijkje een verticale streep van methylcellulose in de depressie van een glazen depressie glijbaan, dan overspoelen met een royale hoeveelheid embryo medium. Met behulp van een brand-gepolijste pipet, overdracht een donor en drie schild-traps hosts onder het oppervlak van de EM op de depressie slide aan de ene kant van de methylcellulose. Kies een donor embryo's die zijn iets jonger dan de gastheren (30-50% epiboly). Met een kleine lus door het lijmen van de uiteinden van een korte lengte van 2-pond-test vislijn in het uiteinde van een capillaire buis, voorzichtig rollen van de donor en de host embryo's omhoog op de top van de methylcellulose strip en vul ze naar beneden in de methylcellulose tot veilig. Als de getransplanteerde cellen dienen te worden gericht op een bepaald domein, de kennis van het schild podium lot kaart 3,4 en de positie van het doel weefsel ten opzichte van het schild is van essentieel belang, zodat gastheer embryo's kunnen goed worden gepositioneerd. Als gastheer embryo's worden geplaatst in de methylcellulose, rol ze in positie, zodat de beoogde regio bovenste, want tijdens de transplantatie de naald zal het embryo tangentiaal in te voeren om de donor cellen te leveren zonder beschadiging van de dooier. - Transplanteren cellen
Plaats de transplantatie naald door het verplaatsen van het in het brandvlak van het embryo. Eerst richten op de donor embryo met behulp van de 10x doelstelling. Verplaats vervolgens het embryo aan de zijkant, en zonder het aanpassen van de focal plane, gebruik maken van de controles van de micromanipulator aan de punt van de transplantatie naald in beeld te brengen. Plaats de micropipet houder en naald op een vrij vlakke hoek, zodat de naald is zo dicht mogelijk bij horizontale als de rand van de depressie op de dia toe wil. Als een embryo is goed gemonteerd in methylcellulose, zal het niet rollen als de transplantatie naald, tenzij het embryo is te oud om de naald gemakkelijk binnen te dringen. De omhullende laag lijkt te verharden als embryo's leeftijd, dus gastrulastadium transplantaties best worden uitgevoerd direct na het schild vorming. Na de koepel fase, de dooier bevindt zich net onder de cellen van de blastoderm kap, die geleidelijk dunner als epiboly verloopt. Om te voorkomen piercing de dooier, de naald moet het embryo betreden op een focal plane dat is net iets dieper dan die van de EVL. Bij het verwijderen van grote aantallen cellen van de donor embryo, beweeg de naald rond als de cellen worden opgenomen, om te voorkomen dat per ongeluk zuigen dooier in de naald. Als cellen van een donor embryo worden getransplanteerd naar meerdere hosts, is het het beste om de donor te gaan met de naald slechts eenmaal in om de mogelijkheid van de schade te minimaliseren. De donor cellen kunnen vervolgens worden overgebracht naar de gewenste locatie in maximaal drie host embryo's. Bij het overbrengen van cellen van twee of meer donor embryo's in een gastheer embryo, is het het beste om cellen uit elk van de donor embryo's te nemen in dezelfde naald transplantatie transplanteren voordat ze naar een gastheer embryo. Dit vermindert schade aan de gastheer embryo, en zorgt ervoor dat de cellen worden overgebracht naar hetzelfde gebied van het embryo, zodat hun gedrag kunnen worden vergeleken. Zeer weinig mengen occurs tussen de donor cellen in het transplantaat naald, daarom moet de cellen worden overgedragen aan een enkele host wanneer er meer dan een donor wordt gebruikt. Om de kans dat de donor cellen zal bijdragen tot het gewenste weefsel te verhogen, te verdrijven van de donor cellen, terwijl de naald wordt getrokken door het beoogde gebied, in tegenstelling tot de neerlegging van de cellen in een enkele pol. Zodra de cel transfers zijn afgerond, de volledige dia plaatst u voorzichtig in een petrischaal en overgieten met Pen / Strep EM. In de komende uren de methylcellulose zal oplossen, het loslaten van de embryo's.
Figuur 1: Microscoop set-up voor het maken van chimere embryo's. A: Een dissectiemicroscoop transplantatie rig bestaat uit een met olie gevulde Hamilton spuit met een micrometer drive (een) aangesloten op een olie-gevulde reservoir (b) en de transplantatie pipet (c) via een 3-weg kraan (d). De transplantatie pipet is gemonteerd op een grove micromanipulator (e) die op een metalen voetplaat (niet afgebeeld) verbonden via een magnetische voet (f). Transplantaties worden uitgevoerd op het podium van een stereomicroscoop (g) zijn uitgerust met bodem-verlichting voor een optimale optiek. B: een samengestelde microscoop transplantatie rig bestaat uit een soortgelijke olie gevulde Hamilton spuit en micrometer drive (a, b) maar in dit geval de transplantatie pipet is gemonteerd op een pipet houder (c), waarvan de X, Y en Z-bewegingen kunnen worden gecontroleerd hetzij door een grove (d) of fijne (e) micromanipulator. In dit voorbeeld is de micromanipulator is gemonteerd op het lichaam van een vaste-fase microscoop, maar het is ook mogelijk om het monteren op het podium van een gewone microscoop. De embryo's, die zijn geïmmobiliseerd in methylcellulose op een depressie glijbaan, worden gevisualiseerd met behulp van een 10x objectief (f). C: Transplant mal voor het immobiliseren van embryo's voor stereomicroscoop transplantaties. Dechorionated embryo's zijn individueel gedropt in putten gemaakt door het gieten van deze schimmel in agarose in een 90mm petrischaal. De afmetingen van de putten worden weergegeven.
Figuur 2: Montage van embryo's voor gastrula-stage transplantaties. A: ideale vorm van een gastrula transplantatie pipet. Een schuine rand met een scherpe punt helpt bij het penetreren van de embryo. B: immobilisatie donor en gastheer embryo's in methylcellulose. Een strook van methylcellulose is vastgelegd in de put van een depressie glijbaan en overspoeld met een royale hoeveelheid embryo medium. Embryo's worden toegevoegd aan het embryo medium en worden opgerold op de methylcellulose met behulp van een kleine lus (C). DG Uitbreiding van embryo's in Fig. 1B. D: De donor embryo is gericht op het makkelijkste toegang voor de pipet toe te staan, aangezien cellen in dit stadium nog niet-gecommitteerde. EG: Shield-stage gastheer embryo's zijn gericht, zodat de doelregio bovenste is. Cellen getransplanteerd in de boxed regio's zal bijdragen aan de dorsale achterhersenen en craniale neurale lijst afgeleid van de links (E) en rechts (G) zijkanten of aan de ventrale achterhersenen en het ruggenmerg (F).
Figuur 3: Afbeeldingen slechts ter illustratie van chimeer embryo's.
(AC) 18hpf chimere embryo's gegenereerd door transplantatie op schild stadium weergegeven in dorsaal aanzicht, anterior aan de linkerkant. (A, B) sorteren functies voor het celoppervlak receptor EphA4 blijkt uit analyse van chimeer embryo's. Left panelen: het samenvoegen van rhodamine-gelabeld (rhod.) donor cellen (rood) en transgene GFP, uitgedrukt in specifieke segmenten achterhersenen (groen). (A) WT cellen dragen bij tot de gehele achterhersenen van een controle chimeer embryo. (B) EphA4-uitgeputte donor cellen zijn uitgesloten van specifieke segmenten in de achterhersenen van een WT host. (C) donorcellen gericht op verschillende delen van de neurale buis in de schild-fase transplantaties. Donorcellen (rood) gericht op de voorhersenen / middenhersenen (linker paneel) of achterhersenen / ruggenmerg (rechter paneel) van een WT gastheer tegen-gekleurd met een EfnB2a antilichaam dat de voorhersenen merken, mid-achterhersenen grens en het middensegment van de achterhersenen (groen). Schaal bars: 50μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gemak waarmee transplantatie kunnen worden gebruikt om meer gerichte hersenschimmen produceren is een van de grote bevoegdheden van de zebravis als een gewerveld dier model. Een wijziging van dit protocol niet hierboven beschreven staat de analyse van de moeder genfunctie voor de genen met een essentiële rol in zygotische ontwikkeling. Aangezien deze mutant vissen niet kunnen overleven tot volwassen leeftijd, is het noodzakelijk om de mutant germinale te zetten in een anders wild-type gastheer embryo, het creëren van "kiembaan klonen" van de mutant cellen. Het genereren van kiembaan mozaïek gaat het transplanteren van primordiale kiemcellen van een mutant donor naar een wild-type gastheer embryo. In tegenstelling tot alle andere cellijnen in het embryo, is de kiem cellijn zeer vroeg in de ontwikkeling die door de erfenis van de moeder determinanten 5,6. Zo is de eerste uitdaging van het maken van mozaïeken kiembaan het identificeren van de primordiale kiemcellen (PGC) in de donor embryo. Op midblastula stadia van de PGC's wonen langs de marge 7,8, zodat het oppakken van 50 tot 100 willekeurige cellen uit de marge van een lijn-gelabeld donor embryo vaak resulteert in de overdracht van PGC's. Toen overgebracht naar het dier pool van een ongelabelde gastheer embryo, de primordiale kiemcellen actief te migreren naar de vermoedelijke gonaden, waar ze ondubbelzinnig kunnen worden na 24 uur van de ontwikkeling geïdentificeerd door hun karakteristieke positie, groot formaat, en kleurstof retentie te wijten aan hun langzame tempo proliferatieve 9-11. Ondertussen donor-afgeleide niet-PGC zal het lot bepaald door hun ligging in het gastland te verwerven: in de eerste plaats voorhersenen en ogen als ze getransplanteerd naar de blastula dier paal. Het injecteren van de gastheer embryo met morpholinos die knock down de doodlopende gen effectief elimineren van de gastheer kiemlijn in een cel-autonome manier, zodat zelfs een enkele donor-afgeleide PGC kan de hele kiembaan 10,12 (CM, persoonlijke waarneming) opnieuw te bevolken. Meer recent heeft een transgene lijn die het mogelijk maakt PGC's kunnen worden gevisualiseerd in levende embryo's tijdens de blastula stadium ontwikkeld 13. Toen stak in de mutant die moederlijke functie moet worden bepaald, zal deze transgene, in combinatie met de doodlopende morpholinos, maken kiembaan transplantaties facile, omdat enkele PGC's kunnen worden geïdentificeerd en getransplanteerd naar een kiembaan-uitgeput host.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Met dank aan de leden van de Moens lab voor nuttige inbreng tijdens het schrijven van dit artikel. HK is post-doctoraal onderzoeker ondersteund door NIH / NICHD verlenen # 5R01HD037909-08. CBM is een onderzoeker met de Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately |
| Pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | protease type XIV” |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4458 | 100x stock |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M-0387 | |
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes, Life Technologies | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter Instrument Co. | BF120-94-10 | |
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | |
| Transplant pipette option 2 | VWR international | #53508-400 | |
| micromanipulator | Narishige International | UMJ-3FC (?) | |
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige International | GJ-1 | |
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | |
| Fine micromanipulator | Narishige International | MMO-203 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | 12560A | |
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. | ||
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose. |
|||
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Raz, E. Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective. Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124, 3157-3165 (1997).
- Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells. Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).
- Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells. Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).
- Weidinger, G. Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target. Development. 129 (1), 25-36 (2002).
- Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
- Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state. Dev Cell. 3, 723-733 (2002).
- Weidinger, G. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).
- Blaser, H. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
