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Biology

Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation

Published: July 17, 2009 doi: 10.3791/1394

Summary

Un guide étape par étape pour générer ciblées embryons de poissons zèbres chimérique par transplantation au stade blastula ou de gastrula.

Abstract

Un des outils les plus puissants utilisés pour mieux comprendre les processus complexes de développement est l'analyse des embryons chimériques. Une chimère est définie comme un organisme qui contient des cellules de plus d'un animal; mosaïques sont un type de chimère dans laquelle les cellules de plus d'un génotype sont mixtes, généralement de type sauvage et mutant. Dans le poisson zèbre, les chimères peuvent être facilement réalisés par transplantation de cellules d'un embryon donateurs dans un embryon hôte au stade approprié embryonnaire. Les cellules du donneur sont étiquetés produites par injection d'un marqueur de la lignée, comme un colorant fluorescent, dans l'embryon au stade d'une cellule. Les cellules du donneur sont étiquetés prélevées sur des embryons donateurs et introduit dans des embryons hôtes non étiquetés en utilisant une huile à commande pipette en verre montée sur un composé ou soit microscope à dissection. Les cellules donneuses peuvent dans certains cas, être ciblés sur une région spécifique ou un tissu de l'embryon en développement stade blastula ou gastrula d'hôte en choisissant un site de transplantation de l'embryon hôte basées sur des cartes sort bien établi.

Protocol

Un guide étape par étape pour générer ciblées embryons de poissons zèbres chimérique par transplantation au stade blastula ou de gastrula.

Un des outils les plus puissants utilisés pour mieux comprendre les processus complexes de développement est l'analyse des embryons chimériques. Une chimère est définie comme un organisme qui contient des cellules de plus d'un animal; mosaïques sont un type de chimère dans laquelle les cellules de plus d'un génotype sont mixtes, généralement de type sauvage et mutant. Dans le poisson zèbre, les chimères peuvent être facilement réalisés par transplantation de cellules d'un embryon donateurs dans un embryon hôte au stade approprié embryonnaire. Les cellules du donneur sont étiquetés produites par injection d'un marqueur de la lignée, comme un colorant fluorescent, dans l'embryon au stade d'une cellule. Les cellules du donneur sont étiquetés prélevées sur des embryons donateurs et introduit dans des embryons hôtes non étiquetés en utilisant une huile à commande pipette en verre montée sur un composé ou soit microscope à dissection. Les cellules donneuses peuvent dans certains cas, être ciblés sur une région spécifique ou un tissu de l'embryon en développement stade blastula ou gastrula d'hôte en choisissant un site de transplantation de l'embryon hôte basées sur des cartes sort bien établi.

Partie 1: Injection embryons de poissons zèbres à l'étape 1-cellule.

  1. Dechorionation enzymatique des embryons au stade 1-cellule.

    Pour embryons protéolytique dechorionate, incuber à l'étape 1-cellule pour ~ 1-5 'dans une solution de 0,5 pronase mg / ml, comme décrit dans le livre Zebrafish 1. Moniter embryons dechorionation près et plonger dans l'embryon moyen (EM) avec Pen / Strep 1 dès que les chorions commencer à visiblement effondrement. Une fois libérés de leurs chorions, embryons au stade blastula et gastrula sont fragiles et se coller au plastique ou se désintégrer s'il est exposé à l'air. Donc conserver des embryons dechorionated immergé dans Pen / Strep EM, le transfert entre des plats à l'aide d'un incendie poli wide-bore pipette en verre, et de maintenir en soit vaisselle en plastique agar-couché (1,2% d'agarose à Pen / Strep EM) ou autoclave les boîtes de Pétri en verre.
  2. L'injection d'embryons dechorionated avec marqueur de lignage.

    Préparer un plat d'injection en insérant une lame de verre à un angle de 45 degrés sur le plus grand partie d'une boîte de Pétri aux trois quarts plein d'agarose à 1,2% faites au stylo / EM Strep. Retrait de la lame après la solidification d'agarose laisse un creux biseauté. Transfert embryons dechorionated dans le creux d'un plat rempli d'injection Pen / Strep EM. Injectez des volumes 1NL de marqueur en utilisant une lignée précisément calibré feu tiré pipette d'injection en verre et une plate-forme d'injection sous pression, comme décrit dans le Livre Zebrafish 1. Injecter des colorants et des bas traceurs lignée poids moléculaire directement dans le jaune d'embryons dechorionated entre le 1 - et 4-cellules étapes. Une solution de 3% de dextran fluorescent est suffisant pour permettre la détection de cellules provenant de donneurs dans les embryons chimériques par plusieurs jours de développement. Lorsque le marqueur lignée est un ARNm codant pour une protéine fluorescente (par exemple, la GFP ou RFP), injecter directement dans la cellule du début des années une cellule d'embryon scène.
  3. L'injection non dechorionated embryons avec un marqueur de lignage.

    Préparer des plats à injection multipoint et en solidifiant 1,2% d'agarose dans EM autour d'un moule avec des puits peu près la même largeur que le diamètre chorion. Transfert non dechorionated embryons dans un plat à injection multipoint et à moitié rempli d'Pen / EM Strep. Retirer l'excès de liquide. Ainsi immobilisé, les embryons peuvent être injectés avec des volumes 1NL de marqueur lignée comme décrit ci-dessus.
  4. Raising embryons injectés pour la transplantation.

    Levez embryons à faible densité (40-50 embryons par boîte) à Pen frais / EM Strep. Stade-match des embryons donateurs et hôte utilisé pour la transplantation d'assez près. Pour les greffes stade de bouclier, l'objectif pour les bailleurs de fonds à légèrement en retard sur les hôtes; note que les embryons injectés ont tendance à être légèrement retardée. Incuber embryons à différentes températures, 25 ° C, 28 ° C et 31 ° C, à échelonner leur développement et à maximiser la fenêtre de temps pendant laquelle les greffes peuvent être réalisées.

Partie 2: Faire embryons de poissons zèbres chimérique par transplantation.

  1. Transplantation à des stades blastula sur le stéréomicroscope
  1. Description de la plate-forme de greffe pour blastula

    L'appareil utilisé pour la transplantation de cellules dans la blastula de poisson zèbre se compose d'une seringue micrométrique entraînement contrôlé par Hamilton (10 l-50 l) fixé par un robinet à trois voies à un réservoir d'huile minérale et d'un porte micropipette à travers une longueur de tube flexible . Après le montage du banc de transplantation, il est rempli d'huile minérale, en prenant soin d'éliminer toutes les bulles d'air du système. La présence d'une bulle d'air aura un impact négatif sur votre capacité à contrôler èmee d'aspiration et de pression. Utiliser un microscope stéréoscopique avec un grossissement assez élevé et de bonnes qualités optiques (idéalement au moins un grossissement de 80x). Le positionnement de la porte micropipette et l'aiguille peut être contrôlé par un micromanipulateur manuelle Narishige, comme pour les injections, mais si la base du stéréoscope est trop large pour permettre un accès facile avec le micromanipulateur, puis un adaptateur qui se fixe au corps de la stéréomicroscope peuvent également être achetés à partir Narishige. Le montage de la micromanipulateur doit être très stable afin d'éviter le transfert des vibrations à l'aiguille de greffe; une base magnétique fonctionne bien à cet effet.
  2. Préparation de la pipette de transplantation

    Transplantation aiguilles sont fabriquées à partir des pipettes capillaires en verre (voir deux options dans le tableau ci-dessous réactifs) qui sont attirés par une bougie douce sur un extracteur d'électrode. Pause la pointe de l'aiguille hors sous un microscope de dissection en utilisant une lame de rasoir arête droite au point où le diamètre interne de l'aiguille est légèrement plus grande que les cellules à transplanter. Tenez la lame de rasoir avec un léger angle afin de créer un biseau et faire le break le plus lisse possible, sans bords dentelés. Pour les greffes stade blastula, le diamètre extérieur de l'aiguille doit mesurer environ 50-60 mm.
  3. Embryons de montage pour la transplantation dans des moules de gélose

    Préparer des plats d'injection en faisant flotter un moule en plastique avec des rangées de protubérances en forme de coin dans une boîte de Pétri qui est à moitié rempli d'fondus agarose à 1,2% dans les EM. Une fois que l'agarose est solidifié, retirer le gabarit, laissant un moule de gélose contenant des lignes de puits triangulaire en forme de chacun, juste assez grand pour contenir un embryon. Remplissez le moule avec la transplantation Pen / Strep EM et de la charge embryons au stade blastula individuellement dans chaque puits avec une pipette en verre polies au feu afin que les embryons donneurs sont placés vers le bas d'une colonne et les embryons hôtes sont placées dans la colonne adjacente.
  4. Transplanter des cellules

    Position embryons transplantés dans les puits sur leurs côtés; repositionner avec la pipette de greffe que nécessaire lors de la transplantation, en prenant soin pas percer le jaune. Placez le plat sur la scène de sorte que lorsque l'aiguille pénètre dans la transplantation d'un embryon, l'aiguille pousse l'embryon contre le mur du fond de son puits. Utilisation du micromanipulateur, abaisser l'aiguille de transplantation dans le plat avec un angle assez raide. Idéalement, l'aiguille de la transplantation doit entrer l'embryon, à un angle d'environ 45 degrés. Une fois la pointe de l'aiguille est en dessous de la surface du milieu de l'embryon, dessiner une petite quantité de milieu embryon dans l'aiguille en tournant le disque micrométrique contrôlant la seringue Hamilton. Pour le contrôle le plus précis, l'interface entre l'huile minérale et le milieu d'embryon doit rester dans le mince partie effilée de l'aiguille, mais pas trop près de la fin. Doucement la position de l'embryon de donateurs avec l'aiguille et ensuite tirer l'aiguille en arrière et entrer le bouchon blastula de l'embryon à la position désirée. Un rapide, durement touchée va pénétrer l'embryon sans le soumettre à rouler. Dresser les cellules du donneur lentement et avec précaution dans l'aiguille. Si les cellules sont prises trop rapidement, ils sont susceptibles de cisaillement. Également éviter de prendre le jaune dans l'aiguille, comme il va se lier à l'huile minérale, qui sera alors de tuer les cellules. Après que le nombre souhaité de cellules est repris, inverser la pression légèrement pour arrêter l'aspiration et retirez l'aiguille de l'embryon. Apportez l'embryon hôte dans la position en déplaçant l'antenne de transplantation. De petits ajustements à la position de l'embryon hôte peut être faite par un léger tournant à l'aide de l'aiguille de transplantation, aussi longtemps que l'on prend soin de ne pas toucher le jaune. Lorsque l'expulsion des cellules du donneur dans l'embryon hôte, éviter d'introduire une grande quantité de milieu embryon ou toute huile minérale, car cela pourrait interférer avec le développement ou tuer l'embryon. La position des cellules le long de l'axe animal-végétal influe sur leur contribution à l'un des trois feuillets embryonnaires, l'endoderme, mésoderme et ectoderme 2,3. En conséquence, les cellules transplantées proche de la marge avant le début de la gastrulation donnera lieu préférentiellement à l'endoderme et le mésoderme, tandis que les cellules transplantées vers le pôle animal contribuera à destins ectodermique, ectoderme de surface les plus couramment, cerveau et les yeux. Ainsi, un degré de ciblage tissulaire peut être accompli même à des stades blastula. Après les transferts de cellules ont été achevés, le transfert des paires de donneurs-hôte pour les puits d'agar recouvert d'une plaque de 24 puits à se développer.
  1. Transplantation à des stades gastrula sur le microscope composé
  1. Description de la plate-forme de greffe

    Cellule des transferts effectués sur un bénéfice microscope composé du contrôle précis de la position de l'aiguille fournie par une huile à trois axes hydrauliquesmicromanipulateur. Cette micromanipulateur contrôle les mouvements fins de la pipette de greffe, tandis que l'aspiration dans la pipette est contrôlé par une seringue micrométrique disque Hamilton similaire à celle utilisée pour les greffes de blastula. Un microscope composé debout avec une scène fixe est préférable d'effectuer les transferts cellule puisque concentrant un tel microscope ne cause pas l'embryon de se déplacer par rapport à la pipette. Toutefois, si un microscope composé réglable étape doit être utilisé, alors le micromanipulateur peut être monté sur la scène plutôt que sur le corps du microscope avec le même effet. Adaptateurs qui offrent des options pour le montage du micromanipulateur soit le stade ou le corps de microscopes composés d'une variété de fabricants sont également disponibles à partir Narishige.
  2. Préparation de la pipette de transplantation

    Transplantation aiguilles sont faites essentiellement comme décrit ci-dessus; pour les transplantations stade gastrula l'ouverture d'aiguille idéale est 30-40 mm. Après la formation de bouclier, la couche enveloppant (EVL) devient plus adhérente, ce qui rend difficile pour l'aiguille de la transplantation de pénétrer l'embryon. Afin de faciliter l'aiguille d'entrée, tirez un barbillon à l'extrémité de l'aiguille en utilisant une microforge. Premièrement, lisse la pointe de l'aiguille en l'amenant à proximité du filament de l'microforge; puis tourner l'aiguille de sorte que la pointe du biseau peuvent prendre contact avec le filament. Une fois la pointe de l'aiguille des contacts du filament, tirez rapidement loin de créer une barbe, ou au harpon. Pour éviter d'endommager les cellules, l'ardillon doivent être droites et la pointe de l'aiguille ne doit pas la courbe
  3. Embryons de montage pour la transplantation dans de la méthylcellulose

    Pour les greffes microscope composé, monter embryons sur une lame de dépression dans une solution à 3% de méthylcellulose (Sigma) dissous dans le milieu de l'embryon. Premièrement, frottis une bande verticale de méthylcellulose dans la dépression d'une lame de la dépression de verre, puis les inondations avec une généreuse quantité de milieu embryon. En utilisant une pipette polie au feu, le transfert d'un donateur et trois bouclier stade accueille sous la surface de l'EM sur la diapositive dépression sur un côté de la méthylcellulose. Choisissez embryons donateurs qui sont légèrement plus jeunes que les hôtes (30-50% épibolie). Avec une petite boucle faite par le collage des extrémités d'une courte longueur de 2 lb de ligne de pêche expérimentale dans l'extrémité d'un tube capillaire, rouler doucement les embryons donateurs et hôte de monter sur le haut de la bande de méthylcellulose et de les farcir descendre dans la méthylcellulose jusqu'à la butée. Si les cellules transplantées doivent être ciblées sur un domaine, la connaissance particulière du sort stade de bouclier de carte de 3,4 et la position du tissu cible par rapport à l'écu est essentielle afin que les embryons hôte peut être positionné correctement. Comme les embryons hôtes sont placées dans la méthylcellulose, les rouler en position de sorte que la région ciblée est la plus élevée, puisque lors de la transplantation de l'aiguille entrera l'embryon tangentiellement à livrer les cellules du donneur, sans endommager le jaune.
  4. Transplanter des cellules

    Position de l'aiguille de transplantation en le déplaçant dans le plan focal de l'embryon. Concentrer d'abord sur l'embryon donneur à l'aide de l'objectif 10x. Puis déplacez l'embryon sur le côté, et sans ajuster le plan focal, utilisez les commandes de l'micromanipulateur pour apporter la pointe de l'aiguille de transplantation dans le foyer. Positionner le porte micropipette et aiguille avec un angle assez peu profonds, de sorte que l'aiguille est aussi proche de l'horizontale que le bord de la dépression sur la lame permettra. Si un embryon est monté correctement dans la méthylcellulose, il ne roulera pas que l'aiguille pénètre dans la transplantation, à moins que l'embryon est trop vieux pour permettre à l'aiguille pour pénétrer facilement. La couche enveloppante semble durcir comme l'âge des embryons, par conséquent, les transplantations sont meilleures stade gastrula réalisée juste après la formation de bouclier. Après l'étape de dôme, le jaune se trouve juste sous les cellules de blastoderme de la PAC, qui s'amincit progressivement comme produit épibolie. Afin d'éviter de percer le jaune, l'aiguille doit pénétrer l'embryon à un plan focal qui est juste légèrement plus profonde que celle de l'EVL. Lorsque vous retirez un grand nombre de cellules de l'embryon donateurs, déplacer l'aiguille autour comme les cellules sont reprises, afin d'éviter accidentellement sucer le jaune dans l'aiguille. Si les cellules d'un embryon donneur sont destinés à être transplantés à plusieurs hôtes, il est préférable d'entrer le donateur avec l'aiguille qu'une seule fois afin de minimiser la possibilité de dommages. Les cellules du donneur peuvent ensuite être transférés à l'emplacement souhaité dans un maximum de trois embryons hôtes. Lors du transfert de cellules provenant de deux ou plusieurs embryons donateurs en un embryon hôte, il est préférable de prélever des cellules provenant de chacun des embryons donateurs dans l'aiguille de transplantation mêmes avant de les transplanter dans un embryon hôte. Cela minimise les dommages à l'embryon d'accueil, et assure que les cellules sont transférées dans la même zone de l'embryon, de sorte que leurs comportements peuvent être comparés. Très peu de mélange d'OCcabots entre les cellules du donneur de greffe au sein de l'aiguille, par conséquent, les cellules doivent être transférés à un hôte unique lorsque plus d'un donneur est utilisé. Afin d'augmenter la probabilité que les cellules du donneur contribuera à le tissu désiré, d'expulser les cellules du donneur alors que l'aiguille est tiré à travers la zone ciblée, par opposition à déposer les cellules dans un bouquet unique. Une fois le transfert de cellules sont terminées, placer la lame entière dans une boîte de Pétri et les inondations soigneusement avec Pen / Strep EM. Au cours des prochaines heures la méthylcellulose va se dissoudre, libérant les embryons.

Figure 1
Figure 1: Microscope set-up pour faire des embryons chimériques. R: Un banc microscope à dissection greffe se compose d'un bain d'huile seringue Hamilton avec un disque micromètre (a) relié à un réservoir rempli d'huile (b) et la greffe (c) par une pipette robinet à 3 voies (d). La pipette greffe est montée sur un micromanipulateur grossier (e) qui est attaché à une plaque de base en métal (non représentée) par un pied magnétique (f). Les transplantations sont réalisées sur la scène d'un stéréomicroscope (g) équipé d'un éclairage de fond pour l'optique optimale. B: une plate-forme de greffe composé de microscope est constitué d'un semblable rempli d'huile seringue Hamilton et le micromètre lecteur (a, b), mais dans ce cas, la pipette greffe est monté sur un porte-pipette (c) dont X, Y et Z mouvements peuvent être contrôlés soit par un grossier (d) ou bien (e) micromanipulateur. Dans cet exemple, le micromanipulateur est monté sur le corps d'un microscope à platine fixe, mais il est également possible de le monter sur la scène d'un microscope ordinaire. Les embryons, qui sont immobilisés dans la méthylcellulose sur une lame de la dépression, sont visualisées en utilisant un objectif 10x (f). C: moule transplantation d'immobilisation pour les transplantations d'embryons stéréomicroscope. Embryons Dechorionated sont lâchés individuellement dans des puits réalisés par moulage de ce moule en agarose dans un plat de Pétri 90mm. Les dimensions des puits sont indiqués.

Figure 2
Figure 2: Montage des embryons pour la gastrula au stade des greffes. A: forme idéale d'une pipette de greffe gastrula. Un biseau avec un bout pointu aides à pénétrer l'embryon. B: L'immobilisation des embryons donateurs et d'accueil en méthylcellulose. Une bande de méthylcellulose est prévue dans le puits d'une lame de dépression et inondé d'une généreuse quantité de milieu embryon. Les embryons sont ajoutés au milieu de l'embryon et sont roulées sur la méthylcellulose en utilisant une petite boucle (C). DG Elargissement des embryons dans la Fig. 1B. D: L'embryon donateurs est orientée pour permettre un accès plus facile pour la pipette, car les cellules à ce stade sont encore engagés. Ex.: Bouclier stade hôte embryons sont orientés de telle sorte que la région cible est la plus élevée. Les cellules transplantées dans les régions en boîte contribuera à rhombencéphale dorsale et la crête neurale crânienne issus de la gauche (E) et droite (G) côtés ou à l'rhombencéphale et la moelle épinière ventrale (F).

Figure 3
Figure 3: des images représentant des embryons chimériques.
(AC) 18hpf embryons chimères générés par la transplantation au stade bouclier montré en vue dorsale, antérieure à la gauche. (A, B) Fonctions de tri des cellules de surface des récepteurs EphA4 révélée par l'analyse des embryons chimériques. Panneaux de gauche: la fusion de marqué à la rhodamine cellules du donneur (rhod.) (rouge) et transgéniques GFP exprimée dans des segments spécifiques du cerveau postérieur (vert). (A) des cellules WT contribuer à l'ensemble du cerveau postérieur de l'embryon chimérique de contrôle. (B) des cellules du donneur EphA4 appauvri sont exclus de segments spécifiques dans le cerveau postérieur d'un hôte WT. (C) Les cellules donneuses ciblées pour les différentes parties du tube neural chez bouclier stade de greffes. Les cellules donneuses (rouge) ciblées pour le prosencéphale / mésencéphale (panneau de gauche) ou rhombencéphale / moelle épinière (à droite) d'un hôte WT contre-colorées avec un anticorps EfnB2a qui marque le prosencéphale, mi-rhombencéphale de frontière et le segment milieu de la rhombencéphale (vert). Barres d'échelle: 50 microns.

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Discussion

La facilité avec laquelle la transplantation peuvent être utilisées pour produire des chimères ciblé est l'une des grandes puissances du poisson zèbre comme modèle vertébré. Une modification de ce protocole n'est pas décrit ci-dessus permet d'analyser la fonction des gènes maternels pour les gènes ayant un rôle essentiel dans le développement zygotique. Comme ces poissons mutants ne peuvent pas survivre jusqu'à l'âge adulte, il est nécessaire de transférer la lignée germinale dans un embryon mutant contraire hôte de type sauvage, créant des «clones germinale" des cellules mutantes. Génération germinale mosaïques consiste à transplanter des cellules germinales primordiales provenant d'un donneur à un mutant embryon hôte de type sauvage. Contrairement à toutes les autres lignées cellulaires de l'embryon, la lignée de cellules germinales est spécifié très tôt dans le développement par l'héritage des déterminants maternels 5,6. Ainsi, le premier défi de faire des mosaïques germinales est d'identifier les cellules germinales primordiales (PGC) dans l'embryon donneur. A des stades midblastula les PGC résident le long de la marge de 7,8, alors ramasser 50-100 cellules aléatoire de la marge d'une lignée marquée embryons donateurs se traduit souvent par le transfert des PGC. Lorsque transférée vers le pôle animal de l'embryon hôte non étiquetés, les cellules germinales primordiales migrent activement vers les gonades présomptive où ils peuvent être identifiés sans ambiguïté moins 24 heures de développement par leur position caractéristique, de grande taille, et la rétention de teinture à cause de leur taux de prolifération lente 9-11. En attendant, provenant de donneurs non PGC va acquérir le sort déterminé par leur localisation dans l'hôte: principalement cerveau et des yeux si elles ont été transplantées dans le pôle animal blastula. L'injection de l'embryon hôte avec morpholinos que renverser le gène impasse éliminer efficacement les cellules germinales hôte d'une façon cellulaire autonome, de sorte que même une seule provenant de donneurs PGC peuvent repeupler la totalité germinale 10,12 (CM, observation personnelle). Plus récemment, une lignée transgénique qui permet de visualiser PGC dans les embryons en direct pendant les stades blastula a été développé 13. Lorsque franchi dans le mutant dont la fonction est la mère d'être déterminée, ce transgène, combinée avec la morpholinos impasse, fera greffes germinale faciles parce PGC unique peut être identifié et transplantée dans un hôte germinale appauvri.

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Acknowledgments

Merci aux membres du laboratoire pour l'entrée Moens utiles lors de la rédaction de cet article. HK est stagiaire post-doctoral soutenu par le NIH / NICHD octroi # 5R01HD037909-08. CBM est un enquêteur de la Howard Hughes Medical Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Injection rig Applied Scientific Instrumentation MPPI-3 Foot pedal can be ordered separately
Pronase Sigma-Aldrich P5147 protease type XIV”
Pen-Strep Sigma-Aldrich P4458 100x stock
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M-0387
Fluorescent dextrans Molecular Probes, Life Technologies various Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162)
Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) Sutter Instrument Co. BF120-94-10
Transplant pipette option 1 World Precision Instruments, Inc. TW100-4
Transplant pipette option 2 VWR international #53508-400
micromanipulator Narishige International UMJ-3FC (?)
Micromanipulator magnetic stand Narishige International GJ-1
Transplant apparatus Sutter Instrument Co. MI-10010
Fine micromanipulator Narishige International MMO-203
Depression slides Fisher Scientific 12560A
Agar molds for injection and transplants AL-AN Mfg, Inc.

Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.

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References

  1. Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
  2. Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
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  4. Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
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  7. Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells. Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).
  8. Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells. Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).
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  10. Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
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  12. Weidinger, G. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).
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Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation
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Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A.,More

Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394, doi:10.3791/1394 (2009).

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