Summary
Nakli ile blastula veya gastrula aşamada hedef kimerik zebrafish embriyolar üretmek için bir adım-adım rehber.
Abstract
Karmaşık gelişim süreçlerini anlamak için kullanılan en güçlü araçlardan biri kimerik embriyoların analizidir. Chimera birden fazla hayvan hücreleri içeren bir organizma olarak tanımlanan mozaikler fazla bir genotip hücreleri genellikle yabani tip ve mutant, karışık olduğu bir tür kabus. Zebra balığı, kuruntulardan kolayca uygun embriyonik aşamada bir dizi embriyo bir donör embriyo hücrelerinin nakli yapılabilir. Etiketli donör hücreleri tek hücreli aşamada embriyo içine böyle bir floresan boya gibi bir soy işaretleyici, enjeksiyon yoluyla üretilir. Etiketli donör hücreler donör embriyolar kaldırılır ve bir bileşik veya diseksiyon mikroskop üzerine monte edilmiş bir yağ kontrollü cam pipet kullanarak etiketsiz ana embriyolara tanıtıldı. Donör hücreleri, bazı durumlarda, belirli bir bölge ya da gelişmekte olan blastula veya gastrula aşamada ana embriyo doku köklü kaderi haritalar dayalı ev sahibi embriyo nakli sitesi seçerek hedefli olabilir.
Protocol
Nakli ile blastula veya gastrula aşamada hedef kimerik zebrafish embriyolar üretmek için bir adım-adım rehber.
Karmaşık gelişim süreçlerini anlamak için kullanılan en güçlü araçlardan biri kimerik embriyoların analizidir. Chimera birden fazla hayvan hücreleri içeren bir organizma olarak tanımlanan mozaikler fazla bir genotip hücreleri genellikle yabani tip ve mutant, karışık olduğu bir tür kabus. Zebra balığı, kuruntulardan kolayca uygun embriyonik aşamada bir dizi embriyo bir donör embriyo hücrelerinin nakli yapılabilir. Etiketli donör hücreleri tek hücreli aşamada embriyo içine böyle bir floresan boya gibi bir soy işaretleyici, enjeksiyon yoluyla üretilir. Etiketli donör hücreler donör embriyolar kaldırılır ve bir bileşik veya diseksiyon mikroskop üzerine monte edilmiş bir yağ kontrollü cam pipet kullanarak etiketsiz ana embriyolara tanıtıldı. Donör hücreleri, bazı durumlarda, belirli bir bölge ya da gelişmekte olan blastula veya gastrula aşamada ana embriyo doku köklü kaderi haritalar dayalı ev sahibi embriyo nakli sitesi seçerek hedefli olabilir.
Bölüm 1: 1-hücre aşamada Zebra balığı Embriyolar enjekte.
- 1-hücreli aşamada embriyo Enzimatik dechorionation.
~ 1-5 'Zebra balığı Kitap 1 açıklandığı gibi 0,5 mg / ml pronase çözümü için 1-hücreli aşamada inkübe proteolitik dechorionate embriyolar. Pen / Strep 1 chorions gözle görülür çöküşü başlar Embriyo Orta Moniter yakından dechorionation ve batığın embriyolar (EM). Bir kere kendi chorions yayımlanan blastula ve gastrula sahne embriyolar, kırılgan ve plastik sopa veya hava ile temas halinde parçalanır. Bu nedenle agar kaplı plastik tabaklar (1.2 Pen / Strep EM% agaroz) veya otoklava cam petri kaplarına ya Pen / Strep EM batık dechorionated embriyolar, geniş çaplı bir yangın cilalı damlalıklı cam kullanarak yemekleri arasında transfer tutmak ve korumak. - Soy işaretleyici ile dechorionated embriyolar enjekte.
% 1.2 agaroz Kalem / EM Strep dörtte üçü tam bir Petri kabı en geniş parçası üzerinde 45 derecelik bir açıyla cam slayt ekleyerek bir enjeksiyon yemeği hazırlayın. Agaroz katılaşma sonra slayt kaldırılması Eğimli bir çukur bırakır. Dechorionated embriyolar enjeksiyon çanağı Pen / Strep EM ile dolu bir çukur içine aktarın. 1nl hacimleri kullanarak soy marker enjekte hassas kalibre yangın çekti cam enjeksiyon pipet ve Zebra balığı Kitap 1 açıklandığı gibi basınçlı enjeksiyon teçhizat,. Boyalar ve düşük molekül ağırlığına sahip soy izleyiciler ve 4-hücreli aşamaları - 1 arasındaki dechorionated embriyoların yumurta sarısı içine doğrudan enjekte edilir. Floresan dekstran% 3 çözüm geliştirme birkaç gün boyunca kimerik embriyolar donör kökenli hücrelerin tespiti için izin vermek yeterli olacaktır. Soy marker floresan protein kodlayan bir mRNA (Örneğin, GFP veya RFP), erken 1-hücre aşamada embriyo hücre içine doğrudan enjekte edilir. - Soy belirteç olmayan dechorionated embriyoların enjekte.
Kuyuları ile koryon çapı yaklaşık aynı genişlikte bir kalıp etrafında EM% 1.2 agaroz somutlaştırarak, çok iyi enjeksiyon yemekleri hazırlayın. Çok iyi enjeksiyon çanağı Kalem ile yarı dolu / EM Strep olmayan dechorionated embriyoların transferi. Aşırı sıvı çıkarın. Bu nedenle yukarıda açıklandığı gibi hareketsiz, embriyoların 1nl hacimleri ile soy marker enjekte edilebilir. - Transplantasyon için enjekte edilen embriyolar yükseltmek.
Taze Kalem düşük yoğunluklu (çanak ortalama 40-50 embriyolar) embriyolar kaldırın / EM Strep. Transplantasyon için oldukça yakından kullanılan donör ve host embriyolar Sahne maç. Kalkan sahne nakli, hosts biraz gerisinde donörlerin amacı; enjekte edilen embriyolar biraz gecikebilir eğiliminde olduğunu. Gelişim sendeleyip nakli yapılabilir olduğu zaman penceresi en üst düzeye çıkarmak için, farklı sıcaklıklarda, 25 ° C, 28 ° C ve 31 ° C embriyolar inkübe edin.
Bölüm 2: kimerik zebrafish embriyolar nakli yapma.
- Stereomikroskopta blastula aşamalarında az Nakli
- Blastula için transplant teçhizat açıklaması
Zebra balığı blastula hücre nakli için kullanılan cihaz esnek bir boru uzunluğu boyunca mineral yağ bir rezervuar ve üç yönlü bir stopcock mikropipet sahibine bağlı bir mikrometre sürücü kontrollü Hamilton şırınga (10 l 50 l) oluşur. . Transplantasyon teçhizat montaj sonra, bu sistemi tüm hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için özen, mineral yağ ile doldurulur. Bir hava kabarcığı varlığı th kontrol yeteneğini olumsuz etkileyeceke emiş ve basınç. Stereomikroskopta oldukça yüksek büyütme ve iyi optikler (en azından ideal 80x büyütme) kullanın. Konumlandırma mikropipet tutucu ve iğne, enjeksiyon için bir Narishige manuel mikromanipülatör tarafından kontrol edilmesi; Ancak, Stereoskop tabanı mikromanipülatör kolay erişime izin vermek için vücudun verdiği bir adaptör çok geniş ise stereomikroskopta Narishige da satın alınabilir. Mikromanipülatör montaj, titreşimleri nakli iğne aktarılması önlemek için çok kararlı olmalıdır; manyetik tabanı bu amaç için iyi çalışır. - Transplantasyon pipet hazırlanması
Transplantasyon iğneler nazik bir elektrot çektirmenin konik çizilir cam kapiller pipetler (reaktifler Aşağıdaki tablo iki seçenekleri görmek) yapılır. Iğnenin iç çapı hücreleri nakledilen olmaktan biraz daha büyük olan nokta düz bir kenar jilet kullanarak bir diseksiyon mikroskop altında iğne ucu kapalı kırın. Pürüzlü kenarlar yok, hafif bir açıyla eğim oluşturmak ve mümkün olduğunca sorunsuz mola yapmak için jilet tutun. Blastula sahne nakli için iğnenin dış çapı yaklaşık 50-60 mm ölçmek gerekir. - Agar kalıpları nakli için Montaj embriyolar
EM erimiş% 1.2 agaroz ile yarım dolu bir Petri kabındaki kama şeklinde çıkıntılar sıraları ile plastik kalıp yüzen enjeksiyon yemekleri hazırlayın. Agaroz katılaşmış sonra, yeterli bir embriyo tutmak için hemen her büyük triangularly şeklinde kuyuların satırları içeren bir agar kalıp bırakarak, şablon çıkarın. Pen / Strep EM ile nakli kalıp doldurun ve donör embriyolar bir sütun ve konak embriyolar bitişik sütun yerleştirilir yerleştirilir böylece bir yangın parlatılmış cam pipet yardımıyla tek tek her bir kuyunun içine blastula dönem embriyoların yük. - Nakli hücreleri
Onların yüzüne nakli kuyularda pozisyon embriyolar; ponksiyon sarısı bakım alınması, nakli sırasında gerekli nakli pipet ile yeniden konumlandırmak. Pozisyonu sahnede çanak böylece bir embriyo nakli iğne girdiğinde, iğne, iyi arka duvara embriyo iter. Mikromanipülatör kullanarak, oldukça dik bir açıyla çanak içine nakli iğne daha düşüktür. İdeal nakli iğne embriyo yaklaşık 45 derecelik bir açıyla girmeniz gerekir. Iğne ucu aşağıdaki embriyonun orta yüzey sonra, Hamilton şırınga kontrol mikrometre sürücü bükerek, iğne içine embriyo orta küçük bir miktar çizin. En hassas kontrol için, mineral yağ ve embriyo orta arasındaki arayüzü ince iğne, konik bir parçası olarak kalması gerektiğini, ancak sonuna kadar çok yakın değil. Yavaşça iğne ile donör embriyo pozisyonu ve daha sonra iğne geri çekmek ve istenen pozisyona embriyosunun blastula kap girin. Hızlı, sert vurdu, rulo neden olmadan embriyo nüfuz edecektir. Iğne içine donör hücrelerinin yavaş ve dikkatli bir şekilde çizin. Hücreleri çok çabuk alınırsa, kesme olasılığı vardır. Ayrıca, mineral yağ, sonra hücrelerini öldürmek bağlamak gibi iğne içine sarısı alarak önlemek. Istenilen sayıda hücre çekildikten sonra, emme durdurmak için basınç biraz ters ve embriyo iğne kaldırmak. Konumunu içine ana embriyo nakli çanak hareket getirin. Bakım sarısı dokunmayın alınır sürece nakli iğne, hafifçe çevirerek, ev sahibi embriyo konumuna küçük ayarlamalar yapılabilir. Ev sahibi embriyo içine donör hücreleri sınırdışı zaman, bu gelişmeyi engelleyebilir veya embriyo öldürebilir, embriyo orta veya herhangi bir mineral yağ büyük miktarda tanıtan kaçının. Hayvan bitkisel ekseni boyunca hücrelerinin pozisyon katkılarından üç germ, endoderm, mezoderm ve ektoderm 2,3 etkiler. Buna göre, önce gastrulasyon başında marjı yakın nakledilen hücrelerin hayvan kutup doğru nakledilen hücrelerin ektodermal kaderi, en yaygın olarak yüzey ektoderm, ön beyin ve gözler katkıda bulunacak olmakla birlikte, endoderm ve mezoderm tercihli yükselmeye verecektir. Böylece doku hedeflemesi derecesi blastula aşamasında bile yapılabilir. Hücre transferleri tamamlandıktan sonra, daha da geliştirmek için bir 24 plaka agar kaplı kuyulara donör-host çiftleri transfer.
- Transplantasyon gastrula aşamada bileşik mikroskop
- Transplant teçhizat açıklaması
Hücre transferleri yapılan iğne pozisyonu hassas kontrolü hidrolik üç eksenli bir yağ ile sağlanan bir bileşik mikroskop yardımımikromanipülatör. Bu mikromanipülatör, nakli pipet ince hareketlerini kontrol, pipet emme blastula nakli için kullanılan bir benzer bir mikrometre sürücü Hamilton şırınga ile kontrol edilir. Sabit bir sahne ile dik bir bileşik mikroskop embriyo pipet göre hareket etmek için böyle bir mikroskop odaklanarak beri hücre transferleri gerçekleştirmek için neden olmaz tercih edilir. Ancak, ayarlanabilir bir aşamalı bileşik mikroskop kullanılması gerekiyorsa, daha sonra mikromanipülatör aynı etkiyi ile sahne yerine mikroskop gövdesine monte edilebilir. Mikromanipülatör üreticilerinin çeşitli bileşik mikroskoplar aşamasında ya da vücut ya da montaj için seçenekler sunar Adaptörler Narishige de mevcuttur. - Transplantasyon pipet hazırlanması
Transplantasyon iğneler yukarıda açıklanan esas olarak yapılmaktadır; gastrula sahne nakli için ideal bir iğne diyafram açıklığı 30-40 mm. Kalkan kurulmasından sonra, saran bir katman (EVL) embriyo nakli iğne nüfuz zor yapma, daha fazla yapışmış olur. Iğne girişini kolaylaştırmak için, bir microforge kullanarak iğne ucunda bir barbus çekin. Birincisi, microforge filament yakın getirerek iğne ucu pürüzsüz; sonra eğim öncü filament ile temas yapabilirsiniz iğne açmak. Iğne kişiler filament öncü sonra, çabucak bir barbus, zıpkın veya oluşturmak için çekin. Hücrelerin zarar görmesini önlemek için, barbus düz olmalı ve iğne ucu eğri olmamalıdır - Metilselüloz nakli için montaj embriyolar
Bileşik mikroskop nakli için, embriyo ortamda çözünmüş metilselüloz (Sigma),% 3'lük solüsyon bir depresyon slayt embriyolar monte edin. İlk olarak, smear sonra embriyo orta bol miktarda cam bir depresyon slayt, sel depresyon metilselüloz dikey bir şerit. Kullanarak, bir yangın cilalı pipetlemeyin metilselüloz bir tarafı depresyon slayt EM yüzeyinin altında bir donör ve üç aşamalı kalkan ev sahipliği transfer. Hosts (% 30-50 epiboly) biraz daha genç donör embriyolar seçin. Yapıştırma, kılcal bir tüp ucunu 2-lb test olta kısa bir uzunluğu sona erer tarafından yapılan küçük bir döngü ile hafifçe metilselüloz şerit üstüne donör ve host embriyolar roll up ve metilselüloz içine şeyler güvenli kadar. Nakledilen hücrelerin böylece ev sahibi embriyolar doğru konumlandırılmış haritası 3,4 ve kalkan göre hedef dokuya pozisyonu önemlidir kalkan sahne kaderi belirli bir etki alanı, bilgi hedeflenen edilmelidir. Iğne sarısında zarar vermeden nakli sırasında donör hücreleri teslim teğet embriyo girecek bu yana, ev sahibi embriyolar metilselüloz yerleştirilir, böylece hedeflenen bölge olduğunu üst pozisyona rulo. - Nakli hücreleri
Embriyo odak düzlemine taşıyarak nakli iğne yerleştirin. 10x objektif kullanılarak donör embriyo üzerinde odaklanır. Sonra yan embriyo hareket ve odak düzlemli bir ayar yapmadan, nakli iğne ucu odak noktası haline getirmek için mikromanipülatör denetimlerini kullanın. Depresyon slayt kenarına izin iğne yatay olarak yakın böylece mikropipet tutucu ve iğne, oldukça sığ bir açıyla yerleştirin. Bir embriyo metilselüloz düzgün bir şekilde monte edilmiş ise embriyo nakli iğne, iğne kolay nüfuz etmesi için çok eski olmadığı sürece girerken, rulo değil. Saran tabaka embriyolar yaş olarak, bu nedenle, gastrula sahne nakli en iyi kalkan oluşumunu hemen sonra yapılır sertleştirmek görünüyor. Kubbe aşamadan sonra, yumurta sarısı, giderek epiboly gelirleri olarak incelir blastodermin kapağı, hücrelerin hemen altında bulunur. Sarısı piercing önlemek için, iğne EVL sadece biraz daha derin bir odak düzlemli embriyo girmeniz gerekir. Donör embriyo hücrelerinin çok sayıda çıkarırken, kazara iğne içine yumurta sarısı emme önlemek için, hücre alınır etrafında iğne taşımak. Birden çok ana bilgisayara bir donör embriyo hücreleri nakledilen edilecekse, donör hasar olasılığını en aza indirmek için sadece bir kez iğne ile girmek için en iyisidir. Donör hücreler daha sonra üç ana embriyoların istenen konuma kadar transfer olabilir. Birine ev sahipliği embriyo hücreleri, iki veya daha fazla donör embriyolar aktarırken, onları bir dizi embriyo nakli önce aynı nakli iğne her donör embriyo hücreleri almak en iyisidir. Bu ana embriyoya zarar en aza indirir ve davranışları ile karşılaştırıldığında, böylece hücrelerin embriyonun aynı alana aktarılır sağlar. Çok az oc karıştırmaBu nedenle, nakli iğne içinde donör hücreleri arasındaki KKO'larının hücreleri birden fazla donör kullanılan tek bir ana bilgisayara transfer edilmelidir. Iğne, aksine tek bir tutam hücrelerin yatırmak için hedef alan üzerinden çekiliyor ise donör hücrelerinin istenen dokuya katkıda bulunması olasılığını artırmak için, donör hücreleri sınırdışı. Hücre transferleri tamamlandığında, Pen / Strep EM ile dikkatli bir petri ve sel içine tüm slayt. Önümüzdeki birkaç saat içinde metilselüloz embriyolar bırakmadan, eriyecektir.
Şekil 1: Mikroskop kimerik embriyolar yapmak için set-up. A: A diseksiyon mikroskobu nakli teçhizat mikrometre sürücü (a), 3-yönlü valfli (d) ile yağ dolu bir rezervuar (b) ve (c) transplant pipet bağlı bir petrol dolu Hamilton şırınga oluşur. Nakli pipet, (f) ile bir manyetik ayak metal bir taban plakası (gösterilmemiştir) bağlı bir kaba mikromanipülatör (e) monte edilir. En iyi optik için alt aydınlatma ile donatılmış bir stereomikroskopta (g) sahnede nakli yapılmaktadır. B: bileşik mikroskop nakli teçhizat benzer bir yağ dolu Hamilton şırınga ve mikrometre sürücü (a, b) oluşur, ancak bu durumda nakli pipet, X, Y ve Z hareketleri kontrol edilebilir bir pipet tutucu (c) üzerine monte edilmiştir (d) bir kaba veya ince (e) mikromanipülatör ya. Bu örnekte, mikromanipülatör sabit bir aşama mikroskop gövdesi üzerine monte edilmiştir, ancak aynı zamanda düzenli bir mikroskop sahne üzerine monte etmek mümkündür. Bir depresyon slayt metilselüloz immobilize olan embriyolar, 10x objektif (f) kullanılarak görüntülendi. C: stereomikroskopta nakli için embriyolar hareketsizleştirir Nakli kalıp. 90mm bir Petri kabındaki agaroz bu kalıba döküm tarafından yapılan kuyulara Dechorionated embriyolar tek tek düştü. Kuyuların boyutları gösterilmiştir.
Şekil 2: gastrula aşamalı nakli için embriyolar Montajı. A: Bir gastrula nakli pipet ideal şekli. Keskin bir ucu konik embriyo nüfuz yardımcı olur. B: metilselüloz donör ve host embriyolar hareketsizleştirir. Metilselüloz bir şerit bir depresyon slayt iyi yatırdı ve cömert bir embriyo orta miktarı ile su basmış. Embriyolar embriyonun orta ve küçük bir döngü kullanarak metilselüloz (C) üzerine alınır. Şekil embriyoların DG genişleme. 1B. D: donör embriyo, bu aşamada hücreler hala kaydedilmemiş olduğundan, kolay erişim için pipet izin yönelik. EG: Shield aşamalı konak embriyolar, böylece hedef bölgenin üst odaklı. Kutulu bölgeye nakledilen hücreler sol (E) ve (G) sağ taraf veya ventral Beyin ve omurilik (F) elde edilen dorsal Beyin ve kraniyal nöral krest katkıda bulunacaktır.
Şekil 3: kimerik embriyoların Temsilcisi görüntüler.
Sol anterior dorsal görünümü gösterilen kalkan aşamada nakli tarafından oluşturulan (AC) 18hpf kimerik embriyolar. Kimerik embriyolar analizi ile ortaya çıkan hücre yüzeyinde reseptör EphA4 Düzenleme fonksiyonları (A, B). Sol paneller: özel Beyin kesimleri (yeşil) olarak ifade rodamin-etiketli (rhod.) donör hücreleri (kırmızı) ve transgenik GFP birleştirme. (A) WT hücreleri kontrol kimerik embriyonun tüm Beyin katkıda bulunur. (B) EphA4 tükenmiş donör hücreleri WT bir konağın Beyin belirli segmentlere dışındadır. (C) Donör hücreleri kalkan aşamalı nakli nöral tüp farklı bölgelerinde hedeflemiştir. Karşı lekeli bir EfnB2a önbeyin işaretleri antikor, orta-arka beyin sınır ve orta segmentte bir WT konağın önbeyin / Ortabeyin (sol panel) veya Beyin / omurilik (sağ panel) hedefleyen donör hücreleri (kırmızı) Beyin (yeşil). Ölçek bar: 50μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transplantasyon hedeflenen kimeralar üretmek için kullanılabilir olan kolaylığı zebrafish omurgalı bir model olarak büyük güçlerin biridir. Yukarıda anlatılan bu protokol bir değişiklik Zigotik gelişiminde önemli rolleri olan genler için anne gen fonksiyonu analizi sağlar. Bu mutant balık yetişkinliğe kadar hayatta kalamaz bu yana, mutant hücreler "germline klonlar", bir başka vahşi tip konak embriyo mutant germline aktarmak için gereklidir. Yaratma germline mozaikler mutant bir donörden yabani tip konak embriyo nakli primordial germ hücreleri içerir. Embriyo diğer tüm hücre soylarının aksine, anne belirleyicileri 5,6 miras germ hücre tarafından çok erken gelişim belirtilir. Böylece, ilk sorun germline mozaikler yapma donör embriyo primordial germ hücrelerinin (PGCs) belirlenmesi. Midblastula aşamalarında PGCs bir soy etiketli donör embriyo marjı 50-100 rastgele hücre toplayıp marjı 7,8 boyunca ikamet sık sık PGCs transfer sonuçlanır . Hayvan direğe etiketsiz bir ev sahibi embriyo transfer, primordial germ hücrelerinin aktif karakteristik pozisyon, büyük boy ve boya tutma, yavaş proliferatif oranı nedeniyle net bir şekilde gelişme 24 saatte tespit edilebilir olası gonad doğru göç 9-11. Blastula hayvan kutup nakledilen olsaydı öncelikle ön beyin ve gözler: Bu arada, non-PGCs host konumlarına göre belirlenen kaderi kazanacaklardır donör türetilmiştir. Çıkmaz gen yıkmak morpholinos ana embriyo enjekte etkili, böylece hücre özerk bir şekilde ev sahibi germline ortadan kaldırmak, hatta tek bir donör kaynaklı PGC tüm germline 10,12 (CM, kişisel gözlem) yeniden doldurmanız. Daha yakın zamanlarda, PGCs blastula aşamalarında canlı embriyolarının görüntülenebilmekte sağlayan bir transgenik hattı 13 geliştirilmiştir. Tek PGCs tespit ve germline-tükenmiş host naklediliyor olabilir, çünkü anne işlevi belirlenecek mutant geçti, ölü sonu morpholinos ile birlikte bu transgen, germline nakli facile yapacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu makalenin yazımı sırasında yararlı giriş için Moens laboratuar üyelerine teşekkür ederiz. HK, Ulusal Sağlık Enstitüsü / NICHD hibe # 5R01HD037909-08 tarafından desteklenen post-doktora araştırmacısı. CBM Howard Hughes Tıp Enstitüsü ile bir araştırmacı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately |
| Pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | protease type XIV” |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4458 | 100x stock |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M-0387 | |
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes, Life Technologies | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter Instrument Co. | BF120-94-10 | |
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | |
| Transplant pipette option 2 | VWR international | #53508-400 | |
| micromanipulator | Narishige International | UMJ-3FC (?) | |
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige International | GJ-1 | |
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | |
| Fine micromanipulator | Narishige International | MMO-203 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | 12560A | |
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. | ||
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose. |
|||
References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Raz, E. Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective. Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124, 3157-3165 (1997).
- Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells. Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).
- Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells. Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).
- Weidinger, G. Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target. Development. 129 (1), 25-36 (2002).
- Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
- Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state. Dev Cell. 3, 723-733 (2002).
- Weidinger, G. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).
- Blaser, H. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
