Summary
Una guía paso a paso para la generación de embriones de pez cebra quimérico dirigido por el trasplante en la fase de blástula o gástrula.
Abstract
Una de las herramientas más poderosas utilizadas para comprender mejor los complejos procesos de desarrollo es el análisis de embriones quiméricos. Una quimera es definido como un organismo que contiene las células de más de un animal, los mosaicos son un tipo de quimera en la que las células de más de un genotipo se mezclan, por lo general de tipo salvaje y mutante. En el pez cebra, las quimeras pueden ser fácilmente realizadas por el trasplante de células de un embrión de donante en un embrión de acogida en la fase embrionaria adecuada. Etiquetados células del donante son generados por la inyección de un marcador de linaje, como un tinte fluorescente, en el embrión en su fase de una célula. Etiquetados células del donante se extraen de embriones de donantes y se introducen en embriones de acogida sin etiquetas usando un aceite con control pipeta de vidrio montado en cualquiera de un compuesto o microscopio de disección. Células del donante pueden, en algunos casos estar dirigida a una región específica o en el tejido del embrión en su fase de desarrollo de host blástula o gástrula por elegir un sitio en el trasplante de embriones de acogida sobre la base de los mapas de destino bien establecido.
Protocol
Una guía paso a paso para la generación de embriones de pez cebra quimérico dirigido por el trasplante en la fase de blástula o gástrula.
Una de las herramientas más poderosas utilizadas para comprender mejor los complejos procesos de desarrollo es el análisis de embriones quiméricos. Una quimera es definido como un organismo que contiene las células de más de un animal, los mosaicos son un tipo de quimera en la que las células de más de un genotipo se mezclan, por lo general de tipo salvaje y mutante. En el pez cebra, las quimeras pueden ser fácilmente realizadas por el trasplante de células de un embrión de donante en un embrión de acogida en la fase embrionaria adecuada. Etiquetados células del donante son generados por la inyección de un marcador de linaje, como un tinte fluorescente, en el embrión en su fase de una célula. Etiquetados células del donante se extraen de embriones de donantes y se introducen en embriones de acogida sin etiquetas usando un aceite con control pipeta de vidrio montado en cualquiera de un compuesto o microscopio de disección. Células del donante pueden, en algunos casos estar dirigida a una región específica o en el tejido del embrión en su fase de desarrollo de host blástula o gástrula por elegir un sitio en el trasplante de embriones de acogida sobre la base de los mapas de destino bien establecido.
Parte 1: La inyección de embriones de pez cebra en la fase 1 de las células.
- Dechorionation enzimática de los embriones de la fase 1 de las células.
A los embriones proteolíticamente dechorionate, incubar en la etapa 1 de las células de ~ 5.1 "en una solución de pronasa 0,5 mg / ml como se describe en el libro de pez cebra 1. Moniter dechorionation cerca y sumergir los embriones en medio de embriones (EM) con penicilina / estreptomicina 1 tan pronto como el corion comienzan a derrumbarse visiblemente. Una vez liberados de sus corion, los embriones de fase de blástula y gástrula son frágiles y se adhieren al plástico o se desintegran cuando se exponen al aire. Por lo tanto, mantener los embriones dechorionated sumergido en penicilina / estreptomicina EM, la transferencia entre los platos con un pulido al fuego de grueso calibre pipeta de vidrio, y mantener en cualquier platos de plástico recubierto de agar (1,2% de agarosa en penicilina / estreptomicina EM) o autoclave platos Petri de vidrio. - Inyección de embriones dechorionated con marcador de linaje.
Prepare un plato de inyección mediante la inserción de una placa de vidrio a un ángulo de 45 grados a través de la parte más ancha de una placa de Petri de tres cuartos de su capacidad de agarosa al 1,2% hecha en penicilina / estreptomicina EM. La eliminación de la diapositiva después de la solidificación de agarosa deja un canal biselado. La transferencia de embriones dechorionated en el seno de un plato lleno de inyección de EM Pen / Strep. Inyectar volúmenes 1NL de marcador de linaje con una calibración precisa de fuego tirado pipeta de vidrio de la inyección y un equipo de inyección a presión, tal como se describe en el libro de pez cebra 1. Inyectar tintes y de bajo peso molecular trazadores linaje directamente en la yema de los embriones dechorionated entre el 1 - y 4-células etapas. Una solución al 3% de los fluorescentes dextrano es suficiente para permitir la detección de células derivadas del donante de embriones quiméricos a través de varios días de desarrollo. Cuando el marcador de linaje es un ARNm que codifica para una proteína fluorescente (por ejemplo, GFP o RFP), se inyecta directamente en la célula de los principios de un embrión en su fase de células. - La inyección no dechorionated embriones con marcador de linaje.
Prepare varios platos y la inyección por solidificación de agarosa al 1,2% en EM alrededor de un molde con los pozos más o menos el mismo ancho que el diámetro del corion. La transferencia de embriones no dechorionated en un plato de inyección multi-media y llena de penicilina / estreptomicina EM. Retire el exceso de líquido. Así inmovilizado, los embriones pueden ser inyectados con volúmenes 1NL de marcador de linaje como se describió anteriormente. - El aumento de los embriones inyectados para el trasplante.
Aumentar los embriones de baja densidad (40-50 embriones por placa) en pluma fresca / estreptococo EM. Etapa del partido que los embriones de donantes y de acogida utilizados para el trasplante muy de cerca. Para proteger a los trasplantes de etapa, el objetivo de los donantes a la zaga ligeramente por detrás de los anfitriones, tenga en cuenta que los embriones inyectados tienden a ser ligeramente retardada. Incubar los embriones a diferentes temperaturas, 25 º C, 28 ° C y 31 ° C, para escalonar su desarrollo y maximizar la ventana de tiempo durante el cual se pueden realizar trasplantes.
Parte 2: Realización de embriones quiméricos pez cebra mediante un trasplante.
- Trasplante en las etapas de blástula en el microscopio estereoscópico
- Descripción del dispositivo de trasplante de blástula
El aparato utilizado para el trasplante de células en el pez cebra blástula se compone de un micrómetro jeringa unidad controlada por Hamilton (10 l-50 l) unido por una llave de tres vías a un depósito de aceite mineral y al titular de una micropipeta a través de una longitud de tubo flexible . Después de montar el equipo de trasplante, que está lleno de aceite mineral, teniendo cuidado de eliminar todas las burbujas de aire del sistema. La presencia de una burbuja de aire tendrá un impacto negativo de su capacidad de controlar ªe de succión y presión. Utilizar un microscopio estereoscópico con un aumento bastante alto y buena óptica (a ser posible por lo menos con un aumento de 80x). La posición del titular de la micropipeta y la aguja puede ser controlado por un micromanipulador manual de Narishige, como las inyecciones, sin embargo, si la base del estereoscopio es demasiado amplia para permitir un fácil acceso con el micromanipulador, a continuación, un adaptador que se conecta al cuerpo de la estereomicroscopio también se pueden comprar en Narishige. El montaje de la micromanipulador debe ser muy estable con el fin de evitar la transferencia de las vibraciones de la aguja del trasplante, una base magnética que funciona bien para este propósito. - Preparación de la pipeta del trasplante
Trasplante de agujas están hechas de pipetas capilares de vidrio (ver las dos opciones en la tabla de abajo reactivos) que se sienten atraídos por la puesta a punto suave en un extractor de electrodos. Romper la punta de la aguja en el marco de un microscopio de disección utilizando una hoja de afeitar borde recto en el punto donde el diámetro interior de la aguja es ligeramente mayor que las células para ser trasplantadas. Sostenga la cuchilla de afeitar en un ligero ángulo para crear un bisel y hacer la pausa lo más suave posible, sin bordes dentados. Para los trasplantes de blástula, el diámetro exterior de la aguja debe medir aproximadamente 50-60 mm. - Montaje para el trasplante de embriones en los moldes de agar
La preparación de platos de la inyección de un molde de plástico flotante, con hileras de protuberancias en forma de cuña en una placa de Petri que está medio lleno con fundido agarosa al 1,2% en el EM. Una vez que la agarosa se ha solidificado, retire la plantilla, dejando un molde de agar que contiene filas de cubas en forma de triangular cada uno lo suficientemente grande como para sostener un embrión. Rellene el molde con el trasplante de penicilina / estreptomicina EM y la carga de embriones blástula etapa individual en cada pocillo con una pipeta de vidrio pulido al fuego para que los embriones de donantes se colocan abajo una columna y los embriones de acogida se colocan en la columna adyacente. - Las células del transplante
Embriones posición en el trasplante de pozos en sus lados, colocar la pipeta con el trasplante, según sea necesario durante el trasplante, teniendo cuidado de no pinchar la yema. Coloque el plato en el escenario para que cuando la aguja entra en el trasplante de un embrión, la aguja que introduce el embrión en la pared trasera de su bien. Utilizando el micromanipulador, bajar la aguja del trasplante en el plato en un ángulo bastante empinado. Lo ideal sería que la aguja debe entrar en el trasplante del embrión en un ángulo de 45 grados. Una vez que la punta de la aguja está por debajo de la superficie del medio de embriones, sacar una pequeña cantidad de medio de embrión en la aguja girando el disco micrométrico el control de la jeringa Hamilton. Para el control más preciso, la interfaz entre el aceite mineral y el medio embrión debe permanecer en la parte delgada y afilada de la aguja, pero no demasiado cerca del final. Suavemente la posición del embrión donante con la aguja y luego sacar la aguja hacia atrás y entrar en la tapa de blástula del embrión en la posición deseada. Un golpe rápido, duro penetrar el embrión sin causar que se vuelque. Elaboración de las células del donante lentamente y con cuidado en la aguja. Si las células se toman con demasiada rapidez, es probable que se corte. También evite tomar la yema hasta en la aguja, ya que se unirá a los aceites minerales, que luego matan a las células. Después de que el número deseado de células ha sido tomado, revertir ligeramente la presión para detener la succión y retire la aguja del embrión. Llevar el embrión de acogida en su posición al mover el plato de trasplante. Pequeños ajustes en la posición del embrión huésped se puede hacer de él con cuidado de inflexión con la aguja el trasplante, siempre y cuando se tenga cuidado de no tocar la yema. Cuando se expulsa a las células del donante en el embrión de acogida, evitar la introducción de una gran cantidad de medio de embrión o el aceite mineral, ya que esto podría interferir con el desarrollo o matan el embrión. La posición de las células a lo largo del eje animal-vegetal influye en su contribución a una de las tres capas germinales, endodermo, mesodermo y ectodermo 2,3. En consecuencia, las células trasplantadas cerca del margen antes del inicio de la gastrulación dará lugar preferentemente a endodermo y mesodermo, mientras que las células trasplantadas hacia el polo animal contribuirá a destinos ectodérmica, más superficie ectodermo, cerebro anterior y los ojos. Así, un grado de focalización de tejido se puede realizar incluso en las etapas de blástula. Después de la transferencia de células se han completado, la transferencia de los pares de acogida de los donantes a los pozos de agar recubierto de una placa de 24 pocillos para desarrollar aún más.
- Trasplante en las etapas de gástrula en el microscopio compuesto
- Descripción del dispositivo de trasplante
Transferencias de células realizado en un microscopio compuesto beneficio de un control preciso de la posición de la aguja siempre por un aceite hidráulico de tres ejesmicromanipulador. Este micromanipulador controla los movimientos finos de la pipeta del trasplante, mientras que el de succión en la pipeta está controlado por una jeringa micrométrica disco Hamilton similar a la utilizada para los trasplantes de blástula. Un microscopio compuesto en posición vertical con un escenario fijo es preferible para la realización de transferencias desde el enfoque de células como un microscopio no hace que el embrión se mueven en relación a la pipeta. Sin embargo, si un microscopio compuesto ajustable etapa debe ser usado, entonces el micromanipulador se puede montar en el escenario en lugar de al cuerpo del microscopio con el mismo efecto. Adaptadores que ofrecen opciones para el montaje del micromanipulador ya sea a la etapa o el cuerpo de los microscopios compuestos de una variedad de fabricantes también están disponibles en Narishige. - Preparación de la pipeta del trasplante
Agujas del trasplante se realizó esencialmente como se describió anteriormente, para los trasplantes de fase de gástrula la apertura de la aguja ideal es 30-40 mm. Después de la formación escudo, la capa envolvente (EVL) se vuelve más adherente, lo que dificulta que la aguja para penetrar en el trasplante del embrión. Para facilitar la entrada de la aguja, tire una púa en el extremo de la aguja con un microforge. En primer lugar, suavizar la punta de la aguja llevándolo cerca del filamento de la microforge, a continuación, gire la aguja de modo que el borde delantero del bisel puede ponerse en contacto con el filamento. Una vez que la punta de la aguja de los contactos del filamento, tire de él rápidamente lejos de crear una púa o arpón. Para evitar dañar las células, la púa debe ser recto y la punta de la aguja no debe curvarse - Montaje para el trasplante de embriones en metilcelulosa
Para los trasplantes de microscopio compuesto, montaje embriones en un portaobjetos de la depresión en una solución al 3% de metilcelulosa (Sigma) disuelta en medio de embrión. En primer lugar, muestra una franja vertical de metilcelulosa en la depresión de un portaobjetos de vidrio de la depresión, luego de inundaciones con una generosa cantidad de medio de embrión. Con una pipeta pulida al fuego, la transferencia de un donante y tres hosts etapa de escudo en la superficie de la EM en la diapositiva la depresión en un lado de la metilcelulosa. Elegir embriones de donantes que son un poco más joven que los anfitriones (30-50% epibolia). Con un pequeño lazo hecho por pegar los extremos de un tramo corto de 2 libras línea de pesca de prueba en el extremo de un tubo capilar, ruede suavemente los embriones de donantes y de acogida para arriba sobre la parte superior de la tira de metilcelulosa y cosas hacia abajo en la metilcelulosa hasta que quede firme. Si las células trasplantadas se se dirijan a un dominio particular del conocimiento, de la suerte etapa escudo mapa 3,4 y la posición de los tejidos diana en relación con el escudo es esencial para que los embriones de acogida puede ser la posición correcta. Como los embriones de acogida se colocan en la metilcelulosa, a rodar en posición de modo que la región en estudio es superior, ya que durante el trasplante de la aguja se introduce el embrión tangencialmente para entregar las células del donante, sin dañar la yema. - Las células del transplante
Posición de la aguja del trasplante con un movimiento en el plano focal del embrión. Centrarse primero en el embrión de los donantes con el objetivo de 10x. A continuación, mueva el embrión a un lado, y sin tener que ajustar el plano focal, utilice los controles de la micromanipulador para que la punta de la aguja de trasplante en el foco. La posición del titular de la micropipeta y la aguja en un ángulo un poco menor, de modo que la aguja es lo más cercano a la horizontal, como el borde de la depresión en la diapositiva se lo permita. Si un embrión está montado correctamente en metilcelulosa, que no ruede cuando la aguja entra en el trasplante, a menos que el embrión es demasiado viejo para permitir que la aguja penetre con facilidad. La capa que envuelve parece endurecer la edad embriones, por lo tanto, los trasplantes de gástrula se realiza mejor después de la formación de escudo. Después de la etapa de cúpula, la yema reside sólo en las células de la tapa del blastodermo, que se adelgaza progresivamente a medida que avanza epibolia. Con el fin de evitar la perforación de la yema, la aguja debe entrar en el embrión en un plano focal que es sólo ligeramente más profundo que el de la EVL. Al retirar un gran número de células del embrión donante, mover la aguja alrededor de las células son tomados, con el fin de evitar que accidentalmente se chupa yema de huevo en la aguja. Si las células de embrión de un donante se trasplantan a varios hosts, lo mejor es entrar en el donante con la aguja de una sola vez con el fin de minimizar la posibilidad de daños. Las células del donante pueden ser transferidos a la ubicación deseada en un máximo de tres embriones de acogida. Cuando la transferencia de células de dos o más embriones de donantes de embriones en la sede de uno, lo mejor es tomar células de cada uno de los embriones de donantes en la aguja del trasplante mismo antes de trasplantar a un embrión de acogida. Esto minimiza el daño al embrión de acogida, y asegura que las células se transfieren a la misma área del embrión, por lo que sus comportamientos pueden ser comparados. Muy poca mezcla entre centroscurs entre las células del donante en el trasplante de la aguja, por lo tanto, las células deben ser transferidos a un solo host cuando más de un donante se utiliza. A fin de aumentar la probabilidad de que las células del donante contribuirá al tejido deseado, expulsar a las células del donante, mientras que la aguja se está elaborando a través del área de orientación, en lugar de depositar las células en un grupo único. Una vez que la transferencia de células se han completado, coloque toda la diapositiva en una placa de Petri y las inundaciones cuidadosamente con penicilina / estreptomicina EM. Durante las próximas horas la metilcelulosa se disuelve, la liberación de los embriones.
Figura 1: Microscopio de puesta a punto para la toma de embriones quiméricos. R: Un equipo de trasplantes microscopio de disección consiste en una emulsión de aceite en la jeringuilla Hamilton con una unidad de micrómetro (a) conectado a un depósito lleno de aceite (b) y el trasplante de pipeta (c) a través de una llave de 3 vías (d). La pipeta de trasplante está montado sobre un micromanipulador grueso (e) que se une a una placa base de metal (no mostrado) a través de una base magnética (f). Los trasplantes se llevan a cabo en el escenario de un microscopio estereoscópico (g) con iluminación de fondo para la óptica óptima. B: un microscopio compuesto equipo de trasplante consiste en un aceite de similares jeringa Hamilton y un micrómetro de la unidad (a, b), pero en este caso, la pipeta del trasplante está montado sobre un soporte de pipeta (c), cuya X, Y y Z movimientos pueden ser controlados ya sea por una gruesa (d) o bien (e) micromanipulador. En este ejemplo, el micromanipulador se monta en el cuerpo de un microscopio fija etapa, sin embargo también es posible montarlo en el escenario de un microscopio normal. Los embriones que se encuentran inmovilizados en metilcelulosa en un portaobjetos de la depresión, se visualizan con un objetivo de 10x (f). C: Trasplante de molde para la inmovilización de los embriones para trasplantes microscopio estereoscópico. Dechorionated embriones se colocan individualmente en los pozos hechos por lanzar este molde en agarosa en una placa de Petri de 90 mm. Las dimensiones de los pozos se muestran.
Figura 2: Montaje de embriones para trasplantes fase de gástrula. A: la forma ideal de una pipeta de transplante de gástrula. Un bisel con una punta afilada ayuda a penetrar en el embrión. B: Inmovilización de embriones de donantes y de acogida para la metilcelulosa. Una tira de metilcelulosa se establece en el pozo de una diapositiva de la depresión y la inundó con una generosa cantidad de medio de embrión. Los embriones se añaden al medio de embrión y se enrollan en la metilcelulosa con un pequeño lazo (C). Dirección General de la ampliación de los embriones en la figura. 1B. D: El embrión de los donantes está orientada a permitir un acceso más fácil a la pipeta, ya que las células en esta etapa todavía están sin confirmar. Por ejemplo: Escudo fase de acogida embriones están orientados de modo que la región de destino es más alta. Las células trasplantadas en las regiones en caja contribuirá al cerebro posterior y dorsal de la cresta neural craneal derivada de la izquierda (E) y el derecho de las partes (G) o en la parte posterior del cerebro y la médula espinal ventral (F).
Figura 3: Imágenes representativas de embriones quiméricos.
(AC), los embriones quiméricos 18hpf generada por el trasplante en la etapa de protección se muestra en la vista dorsal, anterior a la izquierda. (A, B) Clasificación de las funciones de receptor de la célula EphA4 superficie revelados por el análisis de embriones quiméricos. Paneles de la izquierda: fusión de rodamina marcado con células del donante (Rhod.) (rojo) y transgénico GFP expresada en segmentos específicos del cerebro posterior (verde). (A) las células WT contribuir a la parte posterior del cerebro completo de un embrión quimérico de control. (B) EphA4-agotadas las células donantes son excluidos de segmentos específicos en la parte posterior del cerebro de una serie WT. (C) Las células donantes dirigidos a diferentes partes del tubo neural en los trasplantes de la etapa de escudo. Las células del donante (en rojo) dirigidos a la prosencéfalo / mesencéfalo (izquierda) o posterior del cerebro / médula espinal (panel derecho) de una gran cantidad PESO contra-teñidas con un anticuerpo EfnB2a que marca el cerebro anterior, la cobertura media del cerebro posterior y el segmento medio de la rombencéfalo (verde). Las barras de escala: 50 micras.
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Discussion
La facilidad con que el trasplante se puede utilizar para producir quimeras objetivo es una de las grandes potencias del pez cebra como modelo de vertebrados. Una modificación de este protocolo no se ha descrito anteriormente permite el análisis de la función de genes maternos de los genes con un papel esencial en el desarrollo del zigoto. Ya que estos peces mutantes no pueden sobrevivir hasta la edad adulta, es necesario transferir la línea germinal mutante en un embrión de lo contrario anfitrión de tipo salvaje, la creación de "clones de línea germinal" de células mutantes. La generación de la línea germinal mosaicos consiste en trasplantar células germinales primordiales de un donante a un embrión mutante de acogida de tipo salvaje. A diferencia de todos los linajes de células en el embrión, el linaje de células germinales se especifica muy temprano en el desarrollo de la herencia de los determinantes de la madre 5,6. Por lo tanto, el primer desafío de hacer mosaicos de línea germinal es la identificación de las células germinales primordiales (PGC) en el embrión donante. En las etapas midblastula la PGCs residen a lo largo del margen de 7,8, por lo que recoger desde 50 hasta 100 células al azar de la margen de un linaje marcado con embriones de donantes con frecuencia da lugar a la transferencia de PGCs. Cuando se transfiere a el polo animal de un embrión de acogida sin etiquetas, las células germinales primordiales activamente migran hacia la gónada presunto en el que se puede identificar inequívocamente a las 24 horas de desarrollo por su posición característica, de gran tamaño, y la retención de colorante debido a su lenta tasa de proliferación 11.9. Por otra parte, derivado del donante no PGCs adquirirá el destino determinado por su ubicación en el host: principalmente del cerebro anterior y los ojos si se transplantaron al polo animal blástula. Inyectar el embrión de acogida con morfolinos que derribar el gen callejón sin salida eliminar efectivamente la línea germinal de acogida en una celda de manera autónoma, de modo que incluso un solo derivado del donante PGC pueden repoblar toda la línea germinal 10,12 (CM, observación personal). Más recientemente, una línea transgénica que permite PGCs para ser visualizados en embriones vivos durante las etapas de blástula se ha desarrollado 13. Cuando se cruzan en el mutante cuya función maternal se va a determinar, este transgen, en combinación con los morfolinos callejón sin salida, hará que los trasplantes de línea germinal fácil porque PGCs solo pueden ser identificados y se trasplantan a una gran cantidad de línea germinal-agotado.
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Acknowledgments
Gracias a los miembros del laboratorio de Moens para la entrada de ayuda durante la redacción de este artículo. HK es post-doctorado con el apoyo de NIH / NICHD subvención # 5R01HD037909-08. CBM es un investigador del Instituto Médico Howard Hughes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately |
| Pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | protease type XIV” |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4458 | 100x stock |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M-0387 | |
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes, Life Technologies | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter Instrument Co. | BF120-94-10 | |
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments, Inc. | TW100-4 | |
| Transplant pipette option 2 | VWR international | #53508-400 | |
| micromanipulator | Narishige International | UMJ-3FC (?) | |
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige International | GJ-1 | |
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | |
| Fine micromanipulator | Narishige International | MMO-203 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | 12560A | |
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. | ||
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose. |
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References
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Raz, E. Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective. Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).
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