Summary
זהו תפוקה גבוהה cryopreservation זרע פרוטוקול דג הזברה. זרע cryopreserved בפרוטוקול זה יש ממוצע של 25% פוריות הפריה חוץ גופית לאחר מכן והוא יציב לאורך שנים רבות.
Abstract
זוהי שיטה cryopreservation זרע דג הזברה כי הוא עיבוד של שיטת הארווי (הארווי et al., 1982). יש לנו הציג שני שינויים בפרוטוקול המקורי הן לייעל את ההליך מדגם אחידות להגדיל. ראשית, עלינו לנרמל את כל אמצעי האחסון באמצעות מדיה הקפאת זרע כי אינו מכיל את cryoprotectant. זרע שנית, cryopreserved מאוחסנים cryovials במקום צינורות נימי. שיעורי זרע קפוא מפשיר (δ ° C / שעה) הם ככל הנראה שני המשתנים הקריטיים ביותר לשלוט בהליך זה. מסיבה זו, אין תחליף צינורות שונים לאלה שצוינו. עבודה בצוותים של 2 אפשר להקפיא את הזרע של 100 גברים לכל צוות ~ 2 שעות. זרע cryopreserved בפרוטוקול זה יש ממוצע של 25% בפריון (כפי שנמדד במספר העוברים קיימא שנוצר הפריה חוץ גופית מחולק במספר הכולל של ביציות מופרות) וזה פוריות אחוז יציב לאורך שנים רבות.
Protocol
חלק א ': פתרונות הקפאת זרע
1. גינסברג דגים האצבעות (לעשות טרי כל 3 ימים; גינזבורג, 1963)
הערה: הזמנה של תוספת IS חשוב למנוע רטיבות
בשנת 450 מ"ל סטרילי ddH2O לפזר:
- NaCl 3.25 גרם
- 0.125 גרם KCl
- CaCl2 • 2 H2O 0.175 גרם
ואז להוסיף: - NaHCO3 0.10 גרם
תביאו נפח סופי 500 מ"ל עם ddH2O חנות סטרילית ב 4 ° C.
2. בינוני הקפאה (בצע יומי טרי)
- ללא מתנול
- גינזבורג אצבעות דגים 10 מ"ל (טמפ החדר).
- אבקת חלב רזה 1.5 גרם
- עם מתנול
הערה: הזמנה של תוספת IS חשוב למנוע רטיבות- דגים גינזבורג אצבעות 9 מ"ל (טמפ 'חדר).
- מתנול 1 מ"ל
- אבקת חלב רזה 1.5 גרם
לאחר הרכבת התקשורת מקפיא, ומערבבים היטב במשך 20 דקות. על ההקפה שייקר או נדנדה. לפני השימוש, aliquot לתוך צינורות 1 מ"ל Eppendorf, הימנעות בועות על פני השטח.
חלק ב ': חומרים הדרושים הקפאת זרע
חומרים הדרושים הקפאת זרע
- 10 pipettes הפנויה μl (חתול Fisherbrand # 22-358697)
- כוסות 250 מ"ל מים דגים המכיל MESAB / Tricaine
- לצפות כוסות (חתול פיירקס # 9985-75)
- P20 pipetman (או שווה ערך) טיפים
- ספוג בעל דגים (להחזיק זכר תוך סחיטה)
- הביתור מיקרוסקופ עם תאורה מעל הבמה
- מלקחיים שטוחים (למשל סוג Millipore)
- 2.0ml קריוגני בקבוקונים (קורנינג חתול # 430488)
- 10X10 cryoboxes (Nalgene חתול # 03-337-7AA)
- קלקר מיכל מלא ~ 15 ס"מ של ice1 יבש כתוש דק
- 15 מ"ל חרוטי צינורות (פלקון # 352099)
- דיואר בקבוקון המכיל חנקן נוזלי
- לונג מלקחיים (למשל CMS פישר חתול בריאות # 10-316B)
- Cryogloves
- שחזור טנק לגברים
- אחת צינור Eppendorf מלא עם התקשורת ללא הקפאה מתנול
- אחת צינור Eppendorf מלא עם התקשורת הקפאה עם מתנול
- Cryofreezer (למשל טיילור Warton-K-series)
1 שיטה פשוטה להכנת קרח יבש כתוש דק הוא לעטוף אותו במגבת לכתוש אותו עם פטיש. שיטה יעילה יותר היא להשתמש במטחנת קרח יבש, למשל מודל קלוסון RE-2.
חלק ג': שיטת הקפאת זרע
- מרק צינורות נימי: לפני ההתחלה, לסמן את צינורות נימי 10μl עם עט במעבדה ברמה של μl 3.33 (כלומר 16.7 מ"מ מלמטה; איור 1.1)..
- להרדים זכר: זכר מקום (ות) בכוס המכילה MESAB / tricaine מדולל במים דגים (מתכון של "ספר דג הזברה")
- דגים מיובשים: הרדים פעם, להרים דג מחוץ הרדמה בעזרת כף פלסטיק בעדינות כתם דג יבש על מגבת נייר, תשומת לב מיוחדת ייבוש בצד הגחון. מי מפעיל זרע כך חשוב ביסודיות יבש סביב הביב. מיקום דגים מחזיק ספוג, למעלה בצד הגחון (איור 1.2). אם האזור מסביב סנפיר אנאלי עדיין לח, יבש בעדינות עם kimwipe. יש להיזהר שלא לסחוט זרע בטרם עת!
- המקום מסומן צינור נימי מתאם הפה גומי פיפטה הכלול צינורות נימי. המתאם הוא צינור גומי בעל שופר בצד אחד בעל נימי מאידך. לחילופין, צינור נימי ניתן לחבר מזרק המילטון 50μl באמצעות פיסת קצר tygon צינורות בקוטר המתאים.
- מקום זכר תחת היקף ולחשוף את פתיחת ואברי המין בקפידה על ידי הפצת סנפירי גחון בנפרד באמצעות קצה צינור נימי.
- אוספים זרע: לגרש זרע ידי מלטפים בעדינות את צידי הדג עם מלקחיים חלקה (למשל Millipore), או על ידי לוחץ בעדינות את צידי הדג בין האצבע המורה והאגודל. איסוף הזרע בתוך צינור נימי כפי שהוא גירש באמצעות שאיבה עדינה (איור 1.2). הימנע צואה שעשויים להיות מגורש עם הזרע.
- לנרמל את נפח הזרע 3.3 μl: אם את נפח מגיע ל זרע, או עולה סימן עט על צינור נימי (כלומר 16.7 מ"מ או יותר), ולאחר מכן המשך לשלב 8. אם נפח הזרע אינו מגיע בנפח היעד, ואז לנרמל נפח לסמן באמצעות עט בינוני להקפיא ללא מתנול (איור 1.3). הסכום המינימלי של זרע כי מקובל משתנה עם איכות הזרע. הזרע הטוב הוא לבן אטום. זרע ירודה נראית מימית. באופן כללי, אנחנו מקבלים כמו מינימום: 1 זרע טוב μl (או 1 / 3 יעד) ו 2 הזרע עני μl (או 2 / 3 היעד). נפח הוא מנורמל כעת μl 3.3.
- ADD CRYOPROTECTANT לזרע: להתחנף בינוני מקפיא עם מאתנול את סימן כתום (נפח כ הכולל הוא עתה 20 μl;. איור 1.4). לגרש תערובת זרע cryoprotectant על שטח נקי של זכוכית שעון, תשומת לב מיוחדת לא להכניס בועות. לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה ~ 4 פעמים (למנוע החדרת בועות).
- המקום 10μl הזרע אל כל אחד 2 CRYOVIALS: פיפטה 10 μl של הזרע: פתרון cryoprotectant לתוך התחתון של שני cryovials נפרד סומנו בתווית עם מידע רלוונטי (איור 1.5). נע במהירות, מבחנות כובע ושחרר אותם בתחתית בטמפרטורת החדר 15 מ"ל פלקון צינורות אחד cryovial / צינור. שווי פלקון צינור והכנס את זוג cryovial המכילים צינורות פלקון לתוך קרח יבש כתוש.
- הקפאת זרע 20 דקות. על קרח יבש: קרח יבש צריכים להיות בצורת אבקה דקה, לא כדורי. צינורות צריך להיות מוכנס לתוך הקרח היבש עמוק מספיק שרק כמוסות שלהם להראות (איור 1.6). כדי לעקוב אחר צינורות קרח יבש, לתת לכל זוג צינורות פלקון מספר 1-20 (שנכתב על כמוסות) ולהקליט את הזמן הם נכנסים קרח יבש.
- CRYOVIALS המקום לבית חנקן נוזלי:. אחרי הזרע הוקפאה על קרח יבש במשך 20 דקות, ולהעבירם המכילים חנקן נוזלי בקבוק ויסקי. הזרע מאוחסן כאן עד למקום למקפיא חנקן נוזלי. כאשר הנחת בתיבות במקפיא, המקפיא מקום בתיבה בתוך אמבט של חנקן נוזלי, כך דגימות לא לחמם. שימוש במלקחיים מתכת ארוכה כדי להתאושש צלוחיות מבקבוקון ויסקי ולהתמודד עם cryogloves. לחלופין, cryovials ניתן להעביר ישירות לתוך תיבת במקפיא של קרח יבש אם תיבת במקפיא נשמר שקוע חנקן נוזלי במיכל קלקר.
- Cryovials חנות ארוך טווח הקפאה בחנקן נוזלי קריוגני. כדי לשמור על יכולת הקיום של זרע, חשוב צלוחיות מאוחסנים שקוע חנקן נוזלי. מניסיוננו, צלוחיות מאוחסן בשלב אדי לאבד את יכולת הקיום לאורך זמן.
מהירות חשוב! הזמן בין הוספת cryoprotectant ומיקום מבחנות הזרע קרח יבש (כלומר צעדים 60-10) צריך להיות לא יותר מ 30 שניות.
חלק ד ': שיטה הפריה במבחנה באמצעות זרע Cryopreserved
אנו מוצאים כי זה עובד הכי טוב עם שני אנשים. אדם אחד סוחטת ביצים מן הנקבות, ואילו אדם אחר מפשירה את הזרע.
- סט אמבטיה מים 33 ° C.
- הסר cryovial מהמקפיא חנקן נוזלי כדי להעביר חנקן נוזלי המכיל עד בקבוק ויסקי מוכן להפשיר.
- לסחוט מן הנקבות ביצים לתוך צלחת פטרי 35mm פלסטיק. אם אפשר, לנסות להשיג 3 מצמדים של ביצים לשלב לתוך צלחת אחת. אם אתה לא יכול לקבל שלוש הטלות טוב בתוך דקות 1 של המצמד הראשון שלך, ואז להמשיך לשלב 4 (אחד מצמד טוב מספיק). הגדרה של המצמד טוב:> 150 ביצים נחמד להסתכל אחיד (צהבהב, כלומר בפסולת לא לבן מעיד על השפלה). שמור על צלחת מכוסה בעוד הזרע מופשר.
- הסר בקבוקון של חנקן נוזלי ולהסיר הכובע. בקבוקון לטבול במהירות ~ 1 / 2 הדרך אל 33 ° C אמבט מים במשך 8-10 שניות.
- להוסיף במהירות 70 μl בטמפרטורת החדר הנקס על הבקבוקון ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה. מיד מוסיפים ביצים ומערבבים בעדינות עם קצה פיפטה.
- ללא דיחוי, להפעיל זרע וביצים על ידי הוספת 750 μl מים ודגים. מערבולת לערבב. דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר 5 דקות, למלא צלחת עם מים דגים צלחת לדגור על 28 ° C. לאחר 2-3 שעות, ספירה והעברת עוברים פורייה למנות 100mm (50/dish). הרוזן ביצים פוריות, כך תדירות הפריה ניתן לקבוע.
- תשמרי על עצמך טוב של הזחלים! במשך 5 הימים הראשונים, שינוי יומי מים ולהסיר עוברים מתים. שים הזחלים רק כי יש שלפוחיות לשחות לחדר הילדים ביום 5.
חלק ה: נציג תוצאות
השתמשנו במתודולוגיה זו crypreservation לעשות ספריה של 8600 דגימות זרע קפוא לעבד בין השנים 2001 ו - 2003. יש לנו מופשר 106 דגימות אלה וקבע הפוריות שלהם. פריון הוא היחס בין העוברים קיימא המיוצרים הפריה חוץ גופית ב מחולק במספר הכולל של ביצים שהיו מופרות עם הזרע הקפוא. טרי (לא cryporeserved) זרע בדרך כלל יש> פוריות 95%; זרע cryopreserved יש פוריות נמוכה הרבה יותר: ממוצע של 29% (n = 106 בקבוקונים). השתנות הבקבוקון אל הבקבוקון בפריון הוא גדול, החל פחות מ -1% ל גבוה ככל 62%. השתנות זו מיוצגת על ידי הסורגים שגיאה גדולה המייצג סטיית תקן באיור. 2. עם זאת ב 106 דגימות זרע מופשר עד כה חווינו רק פעם אחת 0% פוריות הן דגימות הזרע הצליחו לשחזר את המוטציה לעבד המקביל.
לפי הפשרה מבחנות הזרע מהספרייה שלנו במשך מספר שנים (2001-2008) מצאנו כי הפריון הממוצע של דגימות זרע קפוא בשיטה זו נותרתלאורך זמן יציבה (איור 2). הפריון הממוצע של דגימות זרע קפוא מופשר בשנת 2001 היה 23.5% (בהתבסס על 11 דגימות זרע) ובשנת 2008 היה 25% (בהתבסס על 21 דגימות זרע).
מספר חוקרים אחרים כיום באמצעות פרוטוקול זה הקפאת זרע במעבדות שלהם. אחדים דיווחו על הצלחה טובה עם שיעורי פריון המדגם ל-מדגם השתנות דומה למה צפינו. אחרים נכשלו הדיווחים לבצע פרוטוקול עבודה זה בידיהם. אנו מאמינים כי מקורות סביר של בעיות הם:
- אי להשתמש cryovials המדויק או צינורות חרוטי שהצענו בפרוטוקול, המוביל שיעור שונה של קירור כאשר בקרח יבש;
- אי להשתמש בקרח יבש אבקת, המוביל שיעור תת אופטימלית קירור;
- באמצעות דגים זכרים עם עניים פוריות: אתה צריך לקבל לפחות 1 μl של זרע גברי אחד. ניתן גם לבדוק את פוריות הגבר על ידי ביצוע הפריה חוץ גופית עם זרע טרי, אולם זה יכול להיות מטעה כי זה לוקח זרע טרי מעט מאוד להתקרב פוריות 100%.
- באמצעות תת תקן איכות הביציות בהפריה חוץ גופית בבית. באמצעות כל דבר אבל מצמדים מושלמת תמיד מוביל ליד פוריות 0%, אפילו דגימות זרע כי למעשה יש פריון טוב (מבוסס על הפוריות של הבקבוקון כפולות).
באיור 1. סכמטי של מתודולוגיה הקפאת זרע.
איור 2. Cryopreserved פוריות הזרע נשאר יציב לאורך זמן. פוריות אחוז הוא מספר עוברי קיימא המיוצרים הפריה חוץ גופית ב מחולק במספר הכולל של ביצים שהיו מופרית עם זרע קפוא. "N" מתייחס למספר צלוחיות של זרע cryopreserved אשר פוריות נבדק בשנה המקבילה. ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן. מאז כל בקבוקון זרע הוא מן זכר אחר, בקבוקון ל-בקבוקון השתנות הוא ציין.
Discussion
מספר חוקרים אחרים כיום באמצעות פרוטוקול זה הקפאת זרע במעבדות שלהם. אחדים דיווחו על הפוריות דומה ואת השתנות מדגם זהה ל-לדוגמה ראינו. אחרים נכשלו הדיווחים לבצע פרוטוקול עבודה זה בידיהם. אנו מאמינים כי מקורות סביר של בעיות הם:
- אי להשתמש cryovials המדויק או צינורות חרוטי שהצענו בפרוטוקול, המוביל שיעור שונה של קירור כאשר בקרח יבש;
- אי להשתמש בקרח יבש אבקת, המוביל שיעור תת אופטימלית קירור;
- באמצעות דגים זכרים עם עניים פוריות: אתה צריך לקבל לפחות 1 μl של זרע גברי אחד. ניתן גם לבדוק את פוריות הגבר על ידי ביצוע הפריה חוץ גופית עם זרע טרי, אולם זה יכול להיות מטעה כי זה לוקח זרע טרי מעט מאוד להתקרב פוריות 100%. גדולה יותר, הזכרים צבעוניים יותר וחסונה בדרך כלל לתת זרע באיכות גבוהה יותר.
- באמצעות תת תקן איכות הביציות בהפריה חוץ גופית בבית. באמצעות כל דבר אבל מצמדים מושלמת תמיד מוביל ליד פוריות 0%, אפילו דגימות זרע כי למעשה יש פריון טוב (מבוסס על הפוריות של הבקבוקון כפולות).
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 HG002995 "עיבדו את הגנום דג הזברה: גישה הפוכה גנטיקה" כדי CBM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μl disposable pipettes | Fisher Scientific | 22-358697 | |
| Watch glasses | Pyrex | 9985-75 | |
| 2 ml cryogenic vials | Corning | 430488 | |
| 10 x 10 cryoboxes | Nalge Nunc international | 03-337-7AA | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352099 | |
| Tongs | Fisher Scientific | 10-316B | |
| Cryofreezer | Taylor-Wharton | K-series | For example |
References
- Ginsburg, A. S. Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes. J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).
- Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).
