A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

Summary

Si tratta di un high-throughput protocollo di crioconservazione degli spermatozoi per zebrafish. Spermatozoi crioconservati utilizzando questo protocollo ha una media del 25% la fertilità fertilizzazione in vitro successive ed è stabile per molti anni.

Abstract

Questo è un metodo per la crioconservazione degli spermatozoi zebrafish che è un adattamento del metodo di Harvey (Harvey et al., 1982). Abbiamo introdotto due modifiche al protocollo originale che sia snellire la procedura e il campione uniformità aumentare. Per prima cosa, normalizzare tutti i volumi degli spermatozoi utilizzando supporti di congelamento che non contiene il crioprotettore. In secondo luogo, gli spermatozoi crioconservati sono memorizzati in cryovials invece di tubi capillari. I tassi di sperma congelamento e scongelamento (δ ° C / ora) sono probabilmente le due variabili più critiche per il controllo di questa procedura. Per questo motivo, non sostituire i tubi diversi per quelli specificati. Lavorare in team di 2, è possibile congelare lo sperma di 100 uomini per ogni squadra in circa 2 ore. Spermatozoi crioconservati utilizzando questo protocollo ha una media di 25% la fertilità (misurata come il numero di embrioni vitali generati in una fecondazione in vitro diviso per il numero totale di uova fecondate) e questo fertilità per cento è stabile per molti anni.

Protocol

Parte A: Soluzioni di congelamento dello sperma

1. Ginsberg Pesce Ringers (Fai fresco ogni 3 giorni; Ginsburg, 1963)

NOTA: ORDINE DI OLTRE è importante per evitare PRECIPITAZIONE

In 450 ml sterile ddH2O sciogliere:

• NaCl 3,25 g
• KCl 0,125 g
• CaCl2 • 2 H2O 0,175 g
  Poi aggiungere:
• NaHCO3 0,10 g

Portare il volume finale a 500 ml con ddH2O sterile e conservare a 4 ° C.

2. Media congelamento (Fai fresca al giorno)

1. SENZA Metanolo
   • Pesce Ginsburg Ringers 10 ml (temperatura ambiente).
   • Latte scremato in polvere 1,5 gr
2. Con metanolo
   
   NOTA: ORDINE DI OLTRE è importante per evitare PRECIPITAZIONE
   
   
   • Pesce Ginsburg Ringers 9 ml (temperatura ambiente).
   • 1 ml di metanolo
   • Latte scremato in polvere 1,5 g
   
   Dopo il montaggio dei media congelamento, mescolate bene per 20 minuti. su agitatore orbitale o bilancieri. Prima di utilizzare, in aliquote da 1 ml provette Eppendorf, evitando le bolle di superficie.
   

Parte B: Materiale necessario per il congelamento degli spermatozoi

Materiali necessari per il congelamento degli spermatozoi

1. 10 pipette monouso microlitri (cat Fisherbrand # 22-358697)
2. Bicchieri da 250 ml per i pesci di acqua contenente MESAB / Tricaine
3. orologi occhiali (Pyrex cat # 9985-75)
4. P20 Pipetman (o equivalente) e suggerimenti
5. Spugna titolare pesce (di sesso maschile, mentre a tenere spremitura)
6. Dissezione microscopio con illuminazione stadio sopra
7. Forcipe piatto (ad esempio di tipo Millipore)
8. 2,0 ml fiale criogenico (Corning cat # 430488)
9. 10X10 cryoboxes (Nalgene cat # 03-337-7AA)
10. Contenitore di polistirolo pieno di ~ 15 cm finemente triturato secco ice1
11. 15 ml coniche tubi (Falcon # 352099)
12. Dewar pallone contenente azoto liquido
13. Pinze lunghe (ad esempio CMS Fisher gatto Health Care # 10-316b)
14. Cryogloves
15. Serbatoio di recupero per i maschi
16. Un tubo eppendorf riempito con i media congelamento senza metanolo
17. Un tubo eppendorf riempito con i media di congelamento con metanolo
18. Cryofreezer (ad esempio Taylor-Warton serie K)

¹ Un metodo semplice per fare finemente triturato ghiaccio secco è quello di avvolgerla in un asciugamano e polverizzare con un martello. Un metodo più efficiente è quello di utilizzare una smerigliatrice di ghiaccio secco, ad esempio, il modello Clawson RE-2.

Parte C: metodo di congelamento dello sperma

1. MARK TUBI CAPILLARI: Prima di iniziare, contrassegnare i tubi capillari 10μl con una penna di laboratorio a livello di 3,33 microlitri (cioè 16,7 millimetri dal fondo; vedi Fig. 1.1.).
2. Anestetizzare MASCHILE: maschio Luogo (s) in un bicchiere contenente MESAB / tricaine diluito in acqua pesce (ricetta in "Il libro Zebrafish")
3. SECCO DI PESCE: Una volta anestetizzato, ascensore pesce fuor d'anestetico con un cucchiaio di plastica e con delicatezza macchia pesce secco su un tovagliolo di carta, con particolare attenzione per asciugare il lato ventrale. Acqua attiva sperma quindi è importante asciugare completamente intorno alla cloaca. Pesce posizione sul supporto spugna, in crescita del lato ventrale (fig. 1.2). Se la regione attorno a pinna anale è ancora umida, leggermente asciutto con kimwipe. Fare attenzione a non spremere sperma prematuramente!
4. Luogo segnato capillare in bocca adattatore pipetta in gomma che è incluso con tubi capillari. L'adattatore è un tubo di gomma che ha un boccaglio da un lato e un supporto capillare dall'altro. In alternativa, il capillare può essere collegato ad una siringa Hamilton 50μl attraverso un breve pezzo di tubo Tygon del diametro adeguato.
5. Maschio luogo nell'ambito di applicazione ed esporre l'apertura urogenitale con attenzione la diffusione della pinne pelviche a parte utilizzando le estremità del tubo capillare.
6. RACCOLTA SPERMA: Espellere sperma accarezzando delicatamente ai lati del pesce con una pinza liscia (ad esempio Millipore), oppure premendo delicatamente ai lati del pesce tra il dito indice e il pollice. Raccogliere lo sperma in tubo capillare in quanto viene espulso tramite aspirazione delicata (fig. 1.2). Evitare di feci che può essere espulso con lo sperma.
7. NORMALIZE VOLUME SPERMA A microlitri 3.3: Se il volume di sperma raggiunge o supera il marchio penna sul tubo capillare (cioè 16,7 millimetri o superiore), poi passare al punto 8. Se il volume di sperma non raggiunge volume di destinazione, poi normalizzare il volume a segnare con la penna Media congelare senza metanolo (fig. 1.3). Quantità minima di spermatozoi che sia accettabile varia con la qualità degli spermatozoi. Spermatozoi buoni è bianco e opaco. Spermatozoi poveri sembra acquoso. In generale, accettiamo come minimi: 1 microlitri spermatozoi buoni (o 1 / 3 di destinazione) e 2 spermatozoi microlitri poveri (o 2 / 3 di destinazione). Il volume è ormai normalizzata a 3,3 microlitri.
8. AGGIUNGI crioprotettore A SPERMA: Suck up medio di congelamento CON Metanolo al marchio arancione (circa il volume totale è ora di 20 l;. Fig. 1.4). Espellere miscela sperma e crioprotettore sulla zona pulita di un vetro da orologio, prestando particolare attenzione a non introdurre bolle. Mescolare delicatamente pipettando su e giù ~ 4 volte (evitare l'introduzione di bolle).
9. LUOGO 10μl SPERMA IN OGNI DI 2 CRYOVIALS: Pipettare 10 ml di sperma: soluzione crioprotettore nella parte inferiore di due cryovials separati che sono stati etichettati con le informazioni rilevanti (Fig. 1.5). Muoversi rapidamente, fiale cappuccio e rilasciarli nella parte inferiore della temperatura ambiente 15 ml Falcon tubi-uno provetta Microbank ™ / tubo. Cap Falcon tubo ed inserire la coppia di provetta Microbank ™ contenenti tubi Falcon schiacciato in ghiaccio secco.
10. FERMO DI SPERMA PER 20 MIN. In ghiaccio secco: Il ghiaccio secco deve essere sotto forma di polvere fine, non pellet. I tubi deve essere inserito il ghiaccio secco abbastanza profondo che solo i loro berretti show (fig. 1.6). Al fine di tenere traccia di tubi in ghiaccio secco, dare ad ogni coppia di tubi Falcon un numero da 1-20 (scritto sul caps) e registrare il tempo vanno in ghiaccio secco.
11. CRYOVIALS LUOGO IN AZOTO LIQUIDO:. Dopo lo sperma è stato congelato in ghiaccio secco per 20 minuti, trasferirli ad un liquido contenente azoto vaso Dewar. Spermatozoi viene memorizzato qui fino al momento di mettere in freezer azoto liquido. Quando si posizionano nelle caselle congelatore, congelatore box posto in un bagno di azoto liquido in modo che i campioni non riscaldano. Utilizzare pinze di metallo lungo per recuperare fiale da vaso Dewar e maneggiare con cryogloves. In alternativa, cryovials possono essere trasferiti direttamente dal ghiaccio secco nella casella congelatore se la casella congelatore è tenuta immersa in azoto liquido in un contenitore di polistirolo.
12. Cryovials memorizzare a lungo termine in un congelatore criogenico di azoto liquido. Per mantenere la vitalità degli spermatozoi, è importante che i flaconcini sono conservati immersi in azoto liquido. Nella nostra esperienza, fiale memorizzato nella fase vapore perdono vitalità nel tempo.
    La velocità è importante! Il tempo tra l'aggiunta del crioprotettore e l'immissione fiale di sperma in ghiaccio secco (cioè passi 6-10) dovrebbe essere non più di 30 sec.
    

Parte D: metodo di fecondazione in vitro con lo sperma crioconservati

Troviamo che questo funziona meglio con due persone. Una persona spreme le uova da femmine, mentre l'altra persona si scioglie lo sperma.

1. Impostare un bagno d'acqua a 33 ° C.
2. Togliere dal freezer provetta Microbank ™ azoto liquido e il trasferimento di liquidi contenenti azoto vaso Dewar fino al momento di disgelo.
3. Spremere le uova dalle femmine in 35 millimetri piatto di plastica di Petri. Se possibile, cerca di ottenere 3 grinfie di uova e si combinano in un piatto. Se non è possibile ottenere tre frizioni buon entro 1 minuto della vostra prima frizione, poi passare al punto 4 (una frizione buona è sufficiente). Definizione di una buona frizione:> 150 uova in modo uniforme carina (cioè giallastro, senza residui bianchi indicativo del degrado). Tenere piatto coperto mentre lo sperma è stato scongelato.
4. Rimuovere fiala da azoto liquido e rimuovere il tappo. Fiala rapidamente immergere ~ 1 / 2 strada nel bagno d'acqua a 33 ° C per 8-10 secondi.
5. Aggiungere rapidamente 70 microlitri temperatura ambiente Hanks a fiala e mescolare pipettando su e giù. Aggiungere immediatamente alle uova e mescolare delicatamente con la punta della pipetta.
6. Senza indugio, attivare lo sperma e le uova con l'aggiunta di acqua 750 microlitri di pesce. Mescolare. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente.
7. Dopo 5 minuti, riempire con acqua piatto di pesce e piatti incubare a 28 ° C. Dopo 2-3 ore, il conteggio e il trasferimento degli embrioni fertili ai piatti 100mm (50/dish). Conte uova sterili in modo che la frequenza fecondazione può essere determinato.
8. Abbiate cura delle larve! Per i primi 5 giorni, cambiare l'acqua ogni giorno ed eliminare embrioni morti. Mettete solo le larve che hanno vesciche natatorie in vivaio il giorno 5.

Parte E: Risultati Rappresentante

Abbiamo utilizzato questa metodologia crypreservation per fare una libreria di 8600 campioni di sperma congelato per TILLING tra gli anni 2001 e 2003. Abbiamo scongelati 106 di questi campioni e determinato la loro fertilità. La fertilità è il rapporto degli embrioni vitali prodotto in fecondazione in vitro diviso per il numero totale di uova che sono stati fecondati con lo sperma congelato. Fresco (non cryporeserved) di solito ha la fertilità dello sperma> 95%; spermatozoi crioconservati ha fertilità molto più basso: una media del 29% (n = 106 fiale). Il flaconcino a fiala variabilità della fertilità è di grandi dimensioni, che vanno da meno dell'1% a un massimo del 62%. Questa variabilità è rappresentato dal grande barre di errore rappresentano la deviazione standard in fig. 2. Tuttavia in 106 campioni di sperma scongelato fino ad oggi abbiamo solo una volta sperimentato 0% la fertilità in entrambi i campioni di sperma e non è riuscito a recuperare la mutazione corrispondente TILLING.

Con lo scongelamento fiale di sperma dalla nostra biblioteca, nel corso di diversi anni (2001-2008) abbiamo trovato che la fertilità media dei campioni di sperma congelato da questo metodo rimanestabile nel tempo (Fig. 2). La fertilità media dei campioni di sperma congelato scongelati nel 2001 è stato del 23,5% (basato su 11 campioni di sperma) e nel 2008 era del 25% (sulla base di 21 campioni di sperma).

Un certo numero di altri ricercatori stanno utilizzando questo protocollo di congelamento degli spermatozoi nei loro laboratori. Alcuni hanno riportato un buon successo con tassi di fertilità e il campione a campione variabilità simile a quello che abbiamo osservato. Altri hanno riferito non è riuscito a rendere questo protocollo di lavoro nelle loro mani. Crediamo che probabili fonti di problemi sono:

1. Il mancato utilizzo della cryovials esatta o tubi conici abbiamo suggerito nel protocollo, porta a un diverso tasso di raffreddamento quando in ghiaccio secco;
2. Il mancato uso di polvere di ghiaccio secco, portando ad una sub-ottimale velocità di raffreddamento;
3. Utilizzando pesci di sesso maschile con scarsa fertilità: si dovrebbe ottenere almeno 1 ml di sperma da un singolo maschio. È inoltre possibile verificare la fertilità maschile facendo una fecondazione in vitro con lo sperma fresco, tuttavia questo può essere fuorviante, perché ci vuole molto poco sperma fresco per arrivare vicino al 100% la fertilità.
4. Utilizzando sub-standard uova di qualità nella fecondazione in vitro. Utilizzando tutt'altro che perfetto frizioni porta sempre al vicino allo 0% la fertilità, anche da campioni di sperma che in realtà hanno una buona fertilità (in base alla fertilità del flaconcino duplicato).

Figura 1. Schematica della metodologia di congelamento dello sperma.

Figura 2. Fertilità dello sperma crioconservati rimane stabile nel tempo. Fertilità per cento è il numero di embrioni vitali prodotto in fecondazione in vitro diviso per il numero totale di uova che sono stati fecondati con lo sperma congelato. "N" si riferisce al numero di flaconcini spermatozoi crioconservati cui fertilità è stato testato nel corso dell'anno corrispondente. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Dal momento che ogni fiala di sperma è diverso da un maschio, fiala a fiala variabilità si osserva.

Discussion

Un certo numero di altri ricercatori stanno utilizzando questo protocollo di congelamento degli spermatozoi nei loro laboratori. Alcuni hanno riferito di fertilità simili e lo stesso campione a campione variabilità che abbiamo osservato. Altri hanno riferito non è riuscito a rendere questo protocollo di lavoro nelle loro mani. Crediamo che probabili fonti di problemi sono:

1. Il mancato utilizzo della cryovials esatta o tubi conici abbiamo suggerito nel protocollo, porta a un diverso tasso di raffreddamento quando in ghiaccio secco;
2. Il mancato uso di polvere di ghiaccio secco, portando ad una sub-ottimale velocità di raffreddamento;
3. Utilizzando pesci di sesso maschile con scarsa fertilità: si dovrebbe ottenere almeno 1 ml di sperma da un singolo maschio. È inoltre possibile verificare la fertilità maschile facendo una fecondazione in vitro con lo sperma fresco, tuttavia questo può essere fuorviante, perché ci vuole molto poco sperma fresco per arrivare vicino al 100% la fertilità. Più grandi, i maschi più robusta di colore tipicamente dare di più spermatozoi di qualità superiore.
4. Utilizzando sub-standard uova di qualità nella fecondazione in vitro. Utilizzando tutt'altro che perfetto frizioni porta sempre al vicino allo 0% la fertilità, anche da campioni di sperma che in realtà hanno una buona fertilità (in base alla fertilità del flaconcino duplicato).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μl disposable pipettes	Fisher Scientific	22-358697
Watch glasses	Pyrex	9985-75
2 ml cryogenic vials	Corning	430488
10 x 10 cryoboxes	Nalge Nunc international	03-337-7AA
15 ml conical tubes	Falcon BD	352099
Tongs	Fisher Scientific	10-316B
Cryofreezer	Taylor-Wharton	K-series	For example