Een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en In Vitro Bevruchting

Summary

Dit is een high-throughput sperma cryopreservatie protocol voor zebravis. Sperma gecryopreserveerde gebruik van dit protocol is een gemiddelde van 25% in de daaropvolgende vruchtbaarheid vitro fertilisatie en is stabiel gedurende vele jaren.

Abstract

Dit is een methode voor de zebravis sperma cryopreservatie, dat is een aanpassing van de Harvey methode (Harvey et al.., 1982). We hebben twee wijzigingen in het oorspronkelijke protocol dat zowel de procedure te stroomlijnen en te verhogen monster uniformiteit. Ten eerste hebben we normaliseren allemaal sperma volumes met bevriezing media dat niet bevat de cryoprotectant. Ten tweede, gecryopreserveerd zaadcellen worden opgeslagen in cryovials in plaats van capillaire buisjes. De tarieven van het sperma invriezen en ontdooien (δ ° C / tijd) zijn waarschijnlijk de twee belangrijkste variabelen om de controle in deze procedure. Om deze reden, niet vervangen door andere buizen voor de gespecificeerde. Werken in teams van twee is het mogelijk om bevriezing van de sperma van 100 mannen per team in ~ 2 uur. Sperma gecryopreserveerde gebruik van dit protocol is een gemiddelde van 25% vruchtbaarheid (gemeten als het aantal levensvatbare embryo's gegenereerd in een in vitro bevruchting gedeeld door het totale aantal bevruchte eieren) en dit percentage vruchtbaarheid is stabiel gedurende vele jaren.

Protocol

Deel A: Sperma Freezing Solutions

1. Ginsberg Fish Ringers (Zorg verse elke 3 dagen, Ginsburg, 1963)

LET OP: volgorde van toevoeging is belangrijk om NEERSLAG

In 450 ml steriel ddH2O te ontbinden:

• NaCl 3,25 g
• KCl 0,125 g
• CaCl2 • 2 H2O 0,175 g
  Voeg vervolgens toe:
• NaHCO3 0,10 g

Breng uiteindelijke volume tot 500 ml met een steriele ddH2O en bewaar bij 4 ° C.

2. Invriezen Medium (Make dagverse)

1. ZONDER Methanol
   • Ginsburg Fish Ringers 10 ml (kamer temp.)
   • Poedervorm Magere Melk 1,5 gm
2. Met methanol
   
   LET OP: volgorde van toevoeging is belangrijk om NEERSLAG
   
   
   • Ginsburg Fish Ringers 9 ml (kamer temp.)
   • Methanol 1 ml
   • Poedervorm Magere Melk 1,5 g
   
   Na het monteren van het bevriezen media, goed mengen gedurende 20 minuten. op de orbitale schudder of rocker. Voordat u, aliquot in 1 ml Eppendorf buizen, het vermijden van het oppervlak bubbels.
   

Deel B: Materialen die nodig zijn voor het sperma invriezen

Materialen die nodig zijn voor het sperma invriezen

1. 10 ul wegwerp pipetten (Fisherbrand cat # 22 tot 358.697)
2. 250ml bekers voor vissen water dat MESAB / tricaïne
3. glazen voor horloges (Pyrex cat # 9985-75)
4. P20 Pipetman (of gelijkwaardig) en tips
5. Sponge vis houder (de mannelijke vast te houden terwijl knijpen)
6. Dissectiemicroscoop met bovenstaande podium belichting
7. Platte pincet (bijv. Millipore type)
8. 2,0 ml cryogene flacons (Corning cat # 430488)
9. 10X10 cryoboxes (Nalgene cat # 03-337-7AA)
10. Piepschuim container gevuld met ~ 15 cm uit fijngemalen droge ICE1
11. 15 ml conische buizen (Falcon # 352099)
12. Dewarvat met vloeibare stikstof
13. Lange tang (bijv. CMS Fisher Health Care cat # 10-316B)
14. Cryogloves
15. Vuilwatertank voor mannen
16. Een Eppendorf buis gevuld met bevriezing media zonder methanol
17. Een Eppendorf buis gevuld met bevriezing media met methanol
18. Cryofreezer (bijv. Taylor-Warton K-serie)

¹ Een eenvoudige methode voor het maken van fijngemalen droog ijs is om het te wikkelen in een handdoek en verpulveren met een hamer. Een meer efficiënte methode is het gebruik van een droog ijs slijpmachine, bijvoorbeeld Clawson model RE-2.

Deel C: Sperma vriesmethode

1. MARK capillairen: Voorafgaand aan het begin, de 10μl capillairen markeren met een lab pen op het niveau van 3,33 ui (dat wil zeggen 16,7 mm van de onderkant, zie figuur 1.1.).
2. Verdoven MALE: Plaats mannelijke (s) in bekerglas met MESAB / tricaïne verdund in water vissen (recept in "de zebravis Book")
3. DRY FISH: Eenmaal onder narcose, lift vis uit de verdoving met een plastic lepel en voorzichtig dep droog vis op een papieren handdoek, met bijzondere aandacht voor het drogen van de buikzijde. Water activeert sperma dus is het belangrijk om goed droog rond de cloaca. Positie van vis op spons houder, ventrale zijde naar boven (afb. 1.2). Als regio rond anale vin is nog vochtig is, voorzichtig droog met een kimwipe. Zorg ervoor dat niet knijpen sperma voortijdig!
4. Plaats gemarkeerd capillair in rubber mond pipet adapter die wordt meegeleverd met capillaire buizen. De adapter is een rubberen slang die een mondstuk aan het ene uiteinde en een capillaire de houder aan de andere kant heeft. Als alternatief kan de capillaire buis worden aangesloten op een 50μl Hamilton spuit via een klein stukje van Tygon slang van de juiste diameter.
5. Plaats mannen onder de reikwijdte en bloot de urogenitale opening door voorzichtig het verspreiden van de buikvinnen elkaar met behulp van het einde van het capillair.
6. COLLECT SPERMA: Verdrijf sperma door voorzichtig aaien de zijkanten van de vis met gladde tang (bijv. Millipore), of door zachtjes knijpen de zijkanten van de vissen tussen je wijsvinger en duim. Verzamel sperma in capillair als het is uitgezet met behulp van zachte zuigkracht (afb. 1.2). Voorkomen dat uitwerpselen die kunnen worden uitgezet met sperma.
7. NORMALIZE spermavolume tot 3,3 pl: Als het volume van het sperma bereikt of overschrijdt pen markering op capillair (dat wil zeggen 16,7 mm of meer), ga dan naar stap 8. Als sperma volume niet bereikt doelvolume, daarna normaliseren volume tot pen markeren met behulp van Freeze medium zonder Methanol (Fig. 1.3). Minimale hoeveelheid sperma die aanvaardbaar is afhankelijk van de kwaliteit van sperma. Goed sperma is wit en ondoorzichtig. Slechte spermakwaliteit ziet er waterig. In het algemeen accepteren we als minima: 1 ui goed sperma (of 1 / 3 doel) en 2 pl slechte spermakwaliteit (of 2 / 3 doelstelling). Volume is nu genormaliseerd tot 3,3 pl.
8. ADD cryoprotectant om sperma: Zuig Freezing medium met Methanol op de oranje markering (ca. totaal volume is nu 20 pl;. figuur 1.4). Verdrijven sperma en cryoprotectant mengsel op schone ruimte van een horlogeglas, met speciale aandacht voor niet te introduceren bubbels. Voorzichtig mengen door en neer te pipetteren ~ 4 keer (voorkomen dat er bubbels).
9. PLAATS 10μl SPERMA in elk van de twee CRYOVIALS: Pipetteer 10 ul van het sperma: cryoprotectant oplossing in de bodem van twee afzonderlijke cryovials die zijn voorzien van relevante informatie (Fig. 1.5). Snel bewegen, cap flesjes en laat ze in de bodem van de kamertemperatuur 15 ml Falcon buizen-een cryovial / buis. Cap Falcon buis en steek het paar cryovial-bevattende Falcon buizen in gemalen droog ijs.
10. FREEZE sperma voor 20 MIN. Op droog ijs: Droog ijs moet worden in fijne poedervorm, niet pellets. De buizen moeten worden opgenomen in het droge ijs diep genoeg dat alleen hun caps show (Fig. 1.6). Om de sporen van de buizen in droog ijs te houden, geef elk paar van Falcon buizen een nummer uit 1-20 (geschreven op de caps) en noteer de tijd dat ze gaan in de droog ijs.
11. PLAATS CRYOVIALS in vloeibare stikstof:. Nadat het sperma ingevroren is geweest op droog ijs gedurende 20 min., over te dragen naar een vloeibare stikstof bevattende dewarvat. Sperma wordt hier opgeslagen totdat de tijd om te plaatsen in vloeibare stikstof vriezer. Bij het plaatsen in de diepvries dozen, plaats diepvries doos in een bad van vloeibare stikstof, zodat dat de monsters niet opwarmen. Gebruik lange metalen tang om flesjes te herstellen van dewarvat en met cryogloves handvat. Als alternatief kan cryovials rechtstreeks worden vervoerd van droog ijs in de vriezer in als de vriezer box wordt gehouden ondergedompeld in vloeibare stikstof in een piepschuim container.
12. Store cryovials lange termijn in een cryogene vloeibare stikstof vriezer. Voor een duurzaam behoud levensvatbaarheid van sperma, is het belangrijk dat flacons zijn opgeslagen ondergedompeld in vloeibare stikstof. In onze ervaring, flesjes opgeslagen in de dampfase te verliezen levensvatbaarheid in de tijd.
    Snelheid is belangrijk! De tijd tussen het toevoegen van de cryoprotectant en het plaatsen van sperma flacons in droog ijs (dat wil zeggen de stappen 6-10) mag niet meer dan 30 sec.
    

Deel D: In Vitro Fertilisatie methode met gecryopreserveerd sperma

Wij vinden dat dit het beste werkt met twee personen. Een persoon perst de eieren van de vrouwtjes, terwijl de andere persoon ontdooit het sperma.

1. Stel een waterbad tot 33 ° C.
2. Verwijderen cryovial van vloeibare stikstof vriezer en over te dragen aan vloeibare stikstof bevattende dewarvat pas klaar om te ontdooien.
3. Knijp de eieren van de vrouwtjes in de 35 mm plastic petrischaal. Indien mogelijk, probeer om 3 klauwen van eieren te verkrijgen en in een gerecht te combineren. Als je niet kan krijgen drie goede koppelingen binnen 1 minuut van uw eerste koppeling, ga dan naar stap 4 (een goede koppeling is voldoende). Definitie van een goede koppeling:> 150 gelijkmatig mooie eieren (dat wil zeggen geelachtig, met geen witte puin indicatief van degradatie). Houd de schaal bedekt terwijl het sperma is ontdooid.
4. Verwijder de flacon van vloeibare stikstof en verwijder de dop. Snel onder te dompelen flacon ~ half weg naar 33 ° C waterbad voor 8-10 sec.
5. Voeg snel 70 pl kamertemperatuur Hanks om flesje en meng door en neer te pipetteren. Onmiddellijk toevoegen aan de eieren en meng voorzichtig met pipetpunt.
6. Onverwijld te activeren sperma en eieren door de toevoeging van 750 ul vis water. Swirl te mengen. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur.
7. Na 5 minuten, vaatwasser vullen met vis water en incubeer schotel op 28 ° C. Na 2-3 uur, tellen en overdracht vruchtbare embryo's tot 100mm gerechten (50/dish). Tel onbevruchte eieren, zodat de bevruchting frequentie kan worden bepaald.
8. Zorg goed voor de larven! Voor de eerste 5 dagen, dagelijks te wijzigen water en verwijder dode embryo's. Zet alleen larven die zwemblazen hebben in kwekerij op dag 5.

Deel E: representatieve resultaten

We gebruikten deze crypreservation methodologie om een ​​bibliotheek van 8600 ingevroren sperma monsters te maken voor grondbewerking tussen de jaren 2001 en 2003. We hebben ontdooid 106 van deze monsters en vastberaden hun vruchtbaarheid. Vruchtbaarheid is de verhouding van levensvatbare embryo's geproduceerd in een in vitro bevruchting gedeeld door het totaal aantal eieren die werden bevrucht met het ingevroren sperma. Verse (niet cryporeserved) sperma heeft meestal> 95% vruchtbaarheid; gecryopreserveerd sperma heeft veel lagere vruchtbaarheid: een gemiddelde van 29% (n = 106 flesjes). De flacon-to-flacon variabiliteit van de vruchtbaarheid is groot, variërend van minder dan 1% tot zo hoog als 62%. Deze variabiliteit is vertegenwoordigd door de grote fout bars vertegenwoordigt standaarddeviatie in Fig. 2. Maar in 106 sperma monsters ontdooid tot nu toe hebben we slechts een keer 0% vruchtbaarheid ervaring in zowel sperma monsters en niet de bijbehorende bewerken mutatie terug te krijgen.

Door het ontdooien sperma flacons uit onze bibliotheek in de loop van meerdere jaren (2001-2008) hebben we gevonden dat de gemiddelde vruchtbaarheid van sperma ingevroren monsters door deze methode blijftstabiel in de tijd (afb. 2). De gemiddelde vruchtbaarheid van ingevroren sperma monsters ontdooid in 2001 was 23,5% (gebaseerd op 11 sperma monsters) en in 2008 was 25% (gebaseerd op 21 sperma monsters).

Een aantal andere onderzoekers zijn nu met dit sperma invriezen protocol in hun laboratoria. Sommigen hebben gemeld een goede succes met vruchtbaarheidscijfers en sample-to-sample variabiliteit vergelijkbaar met wat we hebben waargenomen. Anderen hebben naar verluidt niet om dit protocol te werken in hun handen. Wij zijn van mening dat de mogelijke bronnen van problemen zijn:

1. Niet de exacte cryovials of conisch we hebben voorgesteld in het protocol te gebruiken, wat leidt tot een ander niveau van koeling bij in droog ijs;
2. Gebrek aan poeder droog ijs te gebruiken, wat leidt tot een sub-optimale koeling tarief;
3. Met behulp van mannelijke vissen met een slechte vruchtbaarheid: je moet minstens 1 ul van sperma te krijgen van een enkele man. U kunt ook de mannelijke vruchtbaarheid testen door het doen van een in vitro fertilisatie met vers sperma, maar dit kan misleidend zijn, omdat er is weinig vers sperma te krijgen in de buurt van 100% vruchtbaarheid.
4. Met behulp van sub-standaard kwaliteit van eieren in de in vitro fertilisatie. Met behulp van alles maar perfect koppelingen altijd leidt tot bijna 0% vruchtbaarheid, zelfs van sperma monsters die daadwerkelijk hebben een goede vruchtbaarheid (gebaseerd op de vruchtbaarheid van de dubbele flacon).

Figuur 1. Schema van sperma invriezen methodologie.

Figuur 2. Gecryopreserveerd sperma vruchtbaarheid blijft stabiel in de tijd. Procent vruchtbaarheid is het aantal levensvatbare embryo's geproduceerd in een in vitro bevruchting gedeeld door het totaal aantal eieren die werden bevrucht met het ingevroren sperma. "N" verwijst naar het aantal zaadcellen gecryopreserveerde flacons die vruchtbaarheid werd getest in het desbetreffende jaar. Foutbalken geven de standaarddeviatie. Aangezien elke sperma flacon is van een andere man, is flacon-to-flacon wordt waargenomen.

Discussion

Een aantal andere onderzoekers zijn nu met dit sperma invriezen protocol in hun laboratoria. Sommigen hebben gemeld soortgelijke vruchtbaarheid en dezelfde sample-to-sample variabiliteit die we hebben waargenomen. Anderen hebben naar verluidt niet om dit protocol te werken in hun handen. Wij zijn van mening dat de mogelijke bronnen van problemen zijn:

1. Niet de exacte cryovials of conisch we hebben voorgesteld in het protocol te gebruiken, wat leidt tot een ander niveau van koeling bij in droog ijs;
2. Gebrek aan poeder droog ijs te gebruiken, wat leidt tot een sub-optimale koeling tarief;
3. Met behulp van mannelijke vissen met een slechte vruchtbaarheid: je moet minstens 1 ul van sperma te krijgen van een enkele man. U kunt ook de mannelijke vruchtbaarheid testen door het doen van een in vitro fertilisatie met vers sperma, maar dit kan misleidend zijn, omdat er is weinig vers sperma te krijgen in de buurt van 100% vruchtbaarheid. Grotere, meer robuust gekleurde mannetjes meestal geven meer een hogere kwaliteit sperma.
4. Met behulp van sub-standaard kwaliteit van eieren in de in vitro fertilisatie. Met behulp van alles maar perfect koppelingen altijd leidt tot bijna 0% vruchtbaarheid, zelfs van sperma monsters die daadwerkelijk hebben een goede vruchtbaarheid (gebaseerd op de vruchtbaarheid van de dubbele flacon).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μl disposable pipettes	Fisher Scientific	22-358697
Watch glasses	Pyrex	9985-75
2 ml cryogenic vials	Corning	430488
10 x 10 cryoboxes	Nalge Nunc international	03-337-7AA
15 ml conical tubes	Falcon BD	352099
Tongs	Fisher Scientific	10-316B
Cryofreezer	Taylor-Wharton	K-series	For example