Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

Summary

Dies ist ein High-Throughput-Spermien Kryokonservierung Protokoll für Zebrafisch. Sperma kryokonserviert mit diesem Protokoll hat einen Durchschnitt von 25% der Fruchtbarkeit in späteren vitro-Fertilisation und ist über viele Jahre stabil.

Abstract

Dies ist eine Methode zur Zebrafisch Spermien Kryokonservierung, dass eine Anpassung der Harvey-Methode (Harvey et al., 1982) ist. Wir haben zwei Änderungen an dem ursprünglichen Protokoll eingeführt, dass sowohl die Verfahren zu straffen und zu erhöhen Probe Uniformität. Zunächst normalisieren wir alle Spermien Volumes mit dem Gefrierpunkt Medien, die nicht enthält Gefrierschutzmittel. Zweitens kryokonservierten Spermien in Kryoröhrchen statt Kapillarrohre gespeichert. Die Preise von Spermien Einfrieren und Auftauen (δ ° C / Zeit) sind wohl die beiden wichtigsten Variablen, die in diesem Verfahren zu kontrollieren. Aus diesem Grund sind kein Ersatz für verschiedene Rohre für diejenigen angegeben. Arbeiten in Teams von 2 ist es möglich, die Spermien von 100 Männern pro Team in ~ 2 Stunden einfrieren. Sperma kryokonserviert mit diesem Protokoll hat einen Durchschnitt von 25% der Fruchtbarkeit (gemessen als die Anzahl der lebensfähigen Embryonen in einem in-vitro-Fertilisation durch die Gesamtzahl der Eier befruchtet unterteilt erzeugt) und das Prozent Fruchtbarkeit ist über viele Jahre stabil.

Protocol

Teil A: Sperm Freezing-Lösungen

1. Ginsberg Fisch Ringers (Stellen frische alle 3 Tage, Ginsburg, 1963)

Hinweis: Reihenfolge der Zugabe ist WICHTIG Ausfallen verhindern

In 450 ml sterile ddH2O auflösen:

• NaCl 3,25 g
• KCl 0,125 g
• CaCl2 • 2 H2O 0,175 g
  Dann fügen Sie:
• NaHCO3 0,10 g

Bringen Endvolumen von 500 ml mit sterilem ddH2O und lagern bei 4 ° C.

2. Freezing Medium (Machen Sie täglich frisch)

1. Ohne Methanol
   • Ginsburg Fisch Ringers 10 ml (Raumtemp.)
   • Magermilchpulver 1,5 g
2. Mit Methanol
   
   Hinweis: Reihenfolge der Zugabe ist WICHTIG Ausfallen verhindern
   
   
   • Ginsburg Fisch Ringers 9 ml (Raumtemp.)
   • Methanol 1 ml
   • Magermilchpulver 1,5 g
   
   Nach der Montage Einfrieren Medien, gut mischen für 20 min. auf Orbitalschüttler oder Wippe. Vor der Verwendung aliquoter in 1 ml Eppendorf-Röhrchen, die Vermeidung Oberfläche Blasen.
   

Teil B: Materialien für die Spermien Einfrieren benötigt

Materialien für die Spermien Einfrieren benötigt

1. 10 pl Einwegpipetten (Fisherbrand cat # 22-358697)
2. 250ml Becher für Fische Wasser mit MESAB / Tricaine
3. Uhrgläser (Pyrex cat # 9985-75)
4. P20 Pipetman (oder gleichwertig) und Tipps
5. Sponge Fisch Halter (männlich halten, während Quetschen)
6. Präpariermikroskop mit über Bühnenbeleuchtung
7. Flache Pinzette (zB Millipore Typ)
8. 2.0ml Kryoröhrchen (Corning cat # 430488)
9. 10X10 Cryoboxen (Nalgene cat # 03-337-7AA)
10. Styropor-Container mit ~ 15 cm, fein zerkleinert trockene ice1 gefüllt
11. 15 ml konische Röhrchen (Falcon # 352099)
12. Dewar mit flüssigem Stickstoff
13. Lange Zangen (zB CMS Fisher Health Care cat # 10-316B)
14. Kryo-
15. Schmutzwassertank für Männer
16. Ein Eppendorf-Röhrchen mit dem Einfrieren Medien ohne Methanol gefüllt
17. Ein Eppendorf-Röhrchen mit dem Einfrieren Medien mit Methanol gefüllt
18. Cryofreezer (z. B. Taylor-Warton K-Serie)

¹ Ein einfaches Verfahren zur Herstellung von fein zerkleinertem Trockeneis ist, um es in ein Handtuch wickeln und pulverisieren sie mit einem Hammer. Eine effizientere Methode ist es, eine Trockeneis Mühle, z. B. Clawson Modell RE-2 verwenden.

Teil C: Sperm Freezing-Methode

1. MARK Kapillarröhrchen: Vor Beginn, markieren Sie die 10 &mgr; l Kapillarröhrchen mit einem Labor Stift auf dem Niveau von 3,33 ul (dh 16,7 mm von unten, siehe Abb. 1.1.).
2. Betäuben MALE: Platz männlich (s) in Becherglas mit MESAB / Tricaine in Fischwasser (Rezept in "Der Zebrafisch Book") verwässert
3. Trockenfisch: Einmal betäubt, Lift Fisch aus der Narkose mit einem Plastiklöffel und sanft Blot Fisch trocken auf einem Papiertuch, wobei besonderes Augenmerk auf das Trocknen der Bauchseite. Wasser aktiviert Spermien so ist es wichtig, gründlich rund um die Kloake trocken. Position Fisch auf Schwammhalter, Bauchseite nach oben (Abb. 1.2). Wenn Region um Afterflosse ist noch feucht, sanft mit einem trockenen Kimwipe. Achten Sie darauf, nicht quetschen Spermien vorzeitig!
4. Ort markiert Kapillare in Gummi Mund pipettieren Adapter, der mit Kapillaren enthalten ist. Der Adapter ist ein Gummischlauch, dass ein Mundstück an einem Ende und einem Kapillarenhalter auf der anderen Seite hat. Alternativ kann die Kapillare zu einem 50 ul Hamilton Spritze über ein kurzes Stück Tygon-Schlauch der entsprechenden Durchmesser angeschlossen werden.
5. Platz männlich unter den Anwendungsbereich und setzen die urogenitalen Eröffnung durch vorsichtiges Verbreitung der Bauchflossen auseinander mit dem Ende der Kapillare.
6. COLLECT SPERM: Expel Spermien durch leichtes Streicheln der Seiten des Fisches mit glatten Pinzette (zB Millipore), oder durch leichtes Drücken den Seiten des Fisches zwischen Zeigefinger und Daumen. Sammeln Spermien in Kapillare, wie es ist ausgeschlossen mit sanftem Sog (Abb. 1.2). Vermeiden Fäkalien, die mit Spermien ausgeschlossen werden kann.
7. NORMALIZE Samenzellenvolumens auf 3,3 ul: Wenn das Volumen des Spermas erreicht oder überschreitet Stift Zeichen auf Kapillare (dh 16,7 mm oder größer), dann fahren Sie mit Schritt 8 fort. Wenn Spermien Volumen nicht erreicht Zielvolumen, dann normalisieren Volumen Stift markieren Einsatz des Freeze-Medium ohne Methanol (Abb. 1.3). Mindestbetrag von Spermien, die akzeptabel ist, hängt mit der Qualität der Spermien. Gute Spermien ist weiß und undurchsichtig. Schlechte Spermien sieht wässrig. In der Regel übernehmen wir als Minimum: 1 ul gute Spermien (oder 1 / 3 target) und 2 ul schlechte Spermien (oder 2 / 3 target). Volume ist nun auf 3,3 ul normalisiert.
8. ADD Gefrierschutzmittel für Spermien: Suck bis Einfriermedium mit MEthanol zum orangefarbene Markierung (ca. Gesamtvolumen beträgt jetzt 20 ul;. Abb. 1,4). Expel Spermien und Frostschutzmittel-Gemisch auf die saubere Fläche von einem Uhrglas, wobei besonderes Augenmerk auf nicht vorstellen Blasen. Vorsichtig durch Auf-und Abpipettieren ~ 4 mal (zu vermeiden Einführung von Blasen) zu mischen.
9. PLACE 10 &mgr; l Sperma in je 2 Kryoröhrchen: Je 10 ul der Spermien: Gefrierschutzmittel Lösung in den unteren zwei getrennte Kryoröhrchen, dass alle relevanten Informationen (Abb. 1,5) markiert worden sind. Umzug schnell, Kappe Fläschchen und legen Sie sie in den Boden der Raumtemperatur 15 ml Falcon-Tubes-one-Kryoröhrchen / Rohr. Cap Falcon-Röhrchen und setzen Sie das Paar Kryoröhrchen-haltigen Falcon-Röhrchen in zerkleinertem Trockeneis.
10. FREEZE Spermien für 20 MIN. Auf Trockeneis: Trockeneis sollte in feiner Pulverform, nicht Pellets werden. Die Rohre sollten in das Trockeneis eingesetzt tief genug, dass nur ihre Mützen (Abb. 1.6) zeigen werden. Um den Überblick über Rohre in Trockeneis zu halten, geben Sie jedem Paar Falcon-Tubes eine Zahl von 1-20 (geschrieben an den Kappen) und notieren Sie die Zeit, die sie gehen in die Trockeneis.
11. PLACE Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff:. Nach der Spermien wurde auf Trockeneis für 20 min eingefroren, übertragen Sie sie auf einem flüssigen Stickstoff-haltige Dewar. Sperma ist hier bis zum Zeitpunkt, in flüssigem Stickstoff Gefrierschrank gelagert. Beim Platzieren in den Gefrierschrank Boxen, Platz Gefrierfach in einem Bad aus flüssigem Stickstoff, so dass Proben nicht erwärmen. Verwenden Sie lange Metall-Zange Röhrchen aus Dewargefäß erholen und Griff mit Kryo. Alternativ können Kryoröhrchen direkt aus Trockeneis überführt werden in die Tiefkühltruhe, wenn der Gefrierschrank Box gehalten wird eingetaucht in flüssigem Stickstoff in einem Styropor-Behälter.
12. Shop Kryoröhrchen langfristig in einer kryogenen flüssigen Stickstoff Gefrierschrank. Zur Aufrechterhaltung Lebensfähigkeit von Spermien, ist es wichtig, dass Fläschchen gespeichert sind eingetaucht in flüssigem Stickstoff. In unserer Erfahrung, verlieren Fläschchen in der Gasphase gespeichert Lebensfähigkeit im Laufe der Zeit.
    Schnelligkeit ist wichtig! Die Zeit zwischen dem Hinzufügen der Gefrierschutzmittel und Platzierung Spermien Fläschchen in Trockeneis (dh die Schritte 6-10) sollte nicht mehr als 30 Sekunden sein.
    

Teil D: In-Vitro-Fertilisation Methode unter Einsatz von Kryokonservierte Sperm

Wir finden, dass dies am besten mit zwei Personen. Eine Person drückt Eier von Weibchen während die andere Person taut der Spermien.

1. Legen Sie ein Wasserbad auf 33 ° C.
2. Entfernen Sie aus flüssigem Stickstoff Gefrierschrank und Transfer-Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff-haltigen Dewargefäß erst unmittelbar vor der Schneeschmelze.
3. Squeeze Eier vom Weibchen in 35-mm-Petrischale aus Kunststoff. Wenn möglich, versuchen zu 3 Gelege zu erhalten und vereinigen sich zu einem Gericht. Wenn Sie nicht bekommen kann drei gute Kupplungen innerhalb von 1 min Ihrer ersten Kupplung, dann gehen Sie zu Schritt 4 (ein guter Kupplung ist ausreichend). Definition des guten Kupplung:> 150 gleichmäßig gut aussehende Eier (dh gelblich, ohne weiße Rückstände Anzeichen für Degradation). Keep Schüssel abgedeckt, während Spermien aufgetaut.
4. Entfernen Fläschchen aus flüssigem Stickstoff und Kappe entfernen. Schnell tauchen Fläschchen ~ 1 / 2 Weg ins 33 ° C Wasserbad für 8-10 sek.
5. Schnelles Hinzufügen von 70 ul Raumtemperatur Hanks zu Fläschchen und mischen durch Auf-und Abpipettieren. Unmittelbar nach Eier hinzufügen und vorsichtig mischen mit Pipettenspitze.
6. Ohne Verzögerung, aktivieren Spermien und Eier durch Zugabe von 750 ul Fisch Wasser. Swirl zu mischen. Inkubieren 5 min bei Raumtemperatur.
7. Nach 5 min, füllen Teller mit Fisch Wasser und inkubieren Schale bei 28 ° C. Nach 2-3 Stunden, zu zählen und zu übertragen fruchtbaren Embryonen bis 100mm Gerichte (50/dish). Graf unbefruchtete Eier, so dass die Befruchtung Frequenz bestimmt werden kann.
8. Passen Sie gut auf die Larven! Für die ersten 5 Tage, ändern Wasser täglich und entfernen abgestorbene Embryonen. Legen Sie nur Larven, die Schwimmblase haben in den Kindergarten am Tag 5.

Teil E: Repräsentative Ergebnisse

Wir haben dieses crypreservation Methodik, um eine Bibliothek von 8600 eingefrorenen Spermien Proben für TILLING zwischen den Jahren 2001 und 2003 zu machen. Wir haben 106 dieser Proben aufgetaut und bestimmt ihre Fruchtbarkeit. Die Fruchtbarkeit ist das Verhältnis von lebensfähigen Embryonen in einem in-vitro-Fertilisation durch die Gesamtzahl der Eier, die mit dem gefrorenen Sperma befruchtet wurden unterteilt produziert. Fresh (non cryporeserved) Spermien typischerweise> 95% Fruchtbarkeit; kryokonservierten Spermien hat viel niedriger Fruchtbarkeit: durchschnittlich 29% (n = 106 Flaschen). Das Fläschchen-to-Fläschchen Variabilität in der Fruchtbarkeit ist groß und reicht von weniger als 1% auf bis zu 62%. Diese Variabilität ist durch die großen Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung in Abb. dargestellt. 2. Doch in 106 Spermaproben aufgetaut bis heute haben wir nur einmal 0% Fruchtbarkeit bei beiden Samenproben erfahrenen und es versäumt, die entsprechenden TILLING Mutation zu erholen.

Mit dem Auftauen Spermien Fläschchen aus unserer Bibliothek im Laufe von mehreren Jahren (2001-2008) haben wir festgestellt, dass die durchschnittliche Fruchtbarkeit von Sperma-Proben mit dieser Methode eingefroren bleibtüber die Zeit stabil (Abb. 2). Die durchschnittliche Fruchtbarkeit der gefrorenen Sperma-Proben im Jahr 2001 wieder aufgetaut war 23,5% (basierend auf 11 Spermaproben) und in 2008 betrug 25% (basierend auf 21 Spermaproben).

Eine Reihe anderer Forscher sind jetzt mit diesem Sperma Einfrieren Protokoll in ihren Labors. Einige haben gute Erfolge mit Geburtenraten und Probe zu Probe Variabilität ähnlich dem, was wir beobachtet haben, berichtet. Andere haben angeblich nicht, um dieses Protokoll in ihren Händen arbeiten. Wir glauben, dass wahrscheinlichen Quellen von Problemen sind:

1. Die Nichtbeachtung der genauen Kryoröhrchen oder konische wir in das Protokoll vorgeschlagen haben zu verwenden, was zu einer unterschiedlichen Geschwindigkeit der Abkühlung, wenn in Trockeneis;
2. Andernfalls gepudert Trockeneis verwenden, was zu einer sub-optimalen Kühlrate;
3. Mit männlicher Fische mit schlechter Fruchtbarkeit: Sie sollten mindestens 1 ul der Spermien von einem einzigen Männchen bekommen. Sie können auch testen, männliche Fruchtbarkeit, indem Sie eine in-vitro-Fertilisation mit frischem Sperma, dies kann jedoch irreführend sein, weil es sehr wenig frisches Sperma braucht, um nahezu 100% der Fruchtbarkeit bekommen.
4. Mit minderer Qualität Eier in den in-vitro-Fertilisation. Mit alles andere als perfekt Kupplungen führt immer zu nahe bei 0% Fruchtbarkeit, auch von Samenproben, die tatsächlich gute Fruchtbarkeit (basierend auf die Fruchtbarkeit der doppelten Durchstechflasche).

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Spermien Einfrieren Methodik.

Abbildung 2. Kryokonservierte Spermien Fruchtbarkeit bleibt stabil über die Zeit. Prozent Fruchtbarkeit ist die Anzahl der lebensfähigen Embryonen in einem in-vitro-Fertilisation durch die Gesamtzahl der Eier, die mit dem gefrorenen Sperma befruchtet wurden unterteilt produziert. "N" bezieht sich auf die Zahl der kryokonservierten Spermien Fläschchen, deren Fruchtbarkeit wurde in das entsprechende Jahr getestet. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. Da jedes Spermium Durchstechflasche ist aus einem anderen Männchen, Fläschchen-to-Fläschchen Variabilität beobachtet.

Discussion

Eine Reihe anderer Forscher sind jetzt mit diesem Sperma Einfrieren Protokoll in ihren Labors. Einige haben ähnliche Fruchtbarkeit und derselben Probe zu Probe Variabilität, die wir beobachtet haben, berichtet. Andere haben angeblich nicht, um dieses Protokoll in ihren Händen arbeiten. Wir glauben, dass wahrscheinlichen Quellen von Problemen sind:

1. Die Nichtbeachtung der genauen Kryoröhrchen oder konische wir in das Protokoll vorgeschlagen haben zu verwenden, was zu einer unterschiedlichen Geschwindigkeit der Abkühlung, wenn in Trockeneis;
2. Andernfalls gepudert Trockeneis verwenden, was zu einer sub-optimalen Kühlrate;
3. Mit männlicher Fische mit schlechter Fruchtbarkeit: Sie sollten mindestens 1 ul der Spermien von einem einzigen Männchen bekommen. Sie können auch testen, männliche Fruchtbarkeit, indem Sie eine in-vitro-Fertilisation mit frischem Sperma, dies kann jedoch irreführend sein, weil es sehr wenig frisches Sperma braucht, um nahezu 100% der Fruchtbarkeit bekommen. Größer, robust gefärbten Männchen in der Regel mehr geben höhere Qualität der Spermien.
4. Mit minderer Qualität Eier in den in-vitro-Fertilisation. Mit alles andere als perfekt Kupplungen führt immer zu nahe bei 0% Fruchtbarkeit, auch von Samenproben, die tatsächlich gute Fruchtbarkeit (basierend auf die Fruchtbarkeit der doppelten Durchstechflasche).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μl disposable pipettes	Fisher Scientific	22-358697
Watch glasses	Pyrex	9985-75
2 ml cryogenic vials	Corning	430488
10 x 10 cryoboxes	Nalge Nunc international	03-337-7AA
15 ml conical tubes	Falcon BD	352099
Tongs	Fisher Scientific	10-316B
Cryofreezer	Taylor-Wharton	K-series	For example