Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En hög genomströmning Metod för Zebrafish Spermier Frysförvaring och In Vitro Befruktning

doi: 10.3791/1395 Published: July 6, 2009

Summary

Detta är en hög genomströmning spermier frysförvaring protokoll för zebrafisk. Spermier frysförvarade använda det här protokollet har i genomsnitt 25% fertilitet i efterföljande provrörsbefruktning och är stabil under många år.

Abstract

Detta är en metod för zebrafisk spermier frysförvaring som är en anpassning av Harvey metoden (Harvey et al., 1982). Vi har infört två ändringar i det ursprungliga protokollet att både effektivisera förfarandet och öka prov enhetlighet. Först normalisera vi alla spermier volymer med frysning material som inte innehåller frysskyddsmedel. För det andra frysförvarade spermier lagras i cryovials istället för kapillärrör. Den andelen spermier nedfrysning och upptining (δ ° C / tid) är förmodligen de två mest kritiska variabler för att styra i detta förfarande. Av denna anledning inte ersätta annorlunda rör för de specificerade. Arbeta i grupper om två är det möjligt att frysa sperma av 100 män per lag i ~ 2 timmar. Spermier frysförvarade använda det här protokollet har i genomsnitt 25% fertilitet (mätt som antalet livskraftiga embryon genereras i en provrörsbefruktning dividerat med totala antalet befruktade ägg) och denna procent fertilitet är stabilt under många år.

Protocol

Del A: Sperma Frysa Solutions

1. Ginsberg Fisk Ringers (Går färsk var 3 dagar, Ginsburg, 1963)

OBS: Order of tillägg är VIKTIGT att förhindra utfällning

I 450 ml sterilt ddH2O upplösa:

  • NaCl 3,25 g
  • KCl 0,125 g
  • CaCl2 • 2 H2O 0,175 g
    Tillsätt sedan:
  • NaHCO3 0,10 g

Ta slutliga volymen till 500 ml med steril ddH2O och förvara vid 4 ° C.

2. Frysning Medium (Går färsk dagligen)

  1. UTAN Metanol
    • Ginsburg Fisk Ringers 10 ml (rumstemp.)
    • Pulveriserat Skumma Mjölk 1,5 GM
  2. Med metanol

    OBS: Order of tillägg är VIKTIGT att förhindra utfällning

    • Ginsburg Fisk Ringers 9 ml (rumstemp.)
    • Metanol 1 ml
    • Pulveriserat Skumma Mjölk 1,5 g

    Efter montering frysning medier, blanda väl i 20 min. på omloppsbanor shaker eller rocker. Innan du använder, uppmätt till 1 ml Eppendorf-rör, för att undvika bubblor på ytan.

Del B: Material som behövs för spermier frysning

Material som behövs för spermier frysning

  1. 10 l engångspipetter (Fisherbrand katt # 22-358.697)
  2. 250ml bägare för fisk vatten innehållande MESAB / Tricaine
  3. urglas (Pyrex katt # 9985-75)
  4. P20 pipetman (eller motsvarande) och tips
  5. Sponge fisk hållaren (för att hålla män och samtidigt klämma)
  6. Analysera mikroskop med ovan scenljus
  7. Platt peang (t.ex. Millipore typ)
  8. 2.0ml kryogen flaskor (Corning katt # 430.488)
  9. 10x10 cryoboxes (Nalgene katt # 03 till 337-7AA)
  10. Styrofoam container fylld med ~ 15 cm av finkrossade torr ice1
  11. 15 ml koniska rör (Falcon # 352.099)
  12. Dewar kolv med flytande kväve
  13. Lång tång (t ex CMS Fisher Hälsovård katt # 10-316B)
  14. Cryogloves
  15. Smutsvattentank för män
  16. Ett Eppendorf-rör fyllt med frysning media utan metanol
  17. Ett Eppendorf-rör fyllt med frysning media med metanol
  18. Cryofreezer (t.ex. Taylor-Warton K-serien)

1 En enkel metod för att göra fint krossad torris är att linda in det i en handduk och pulverisera den med en hammare. En effektivare metod är att använda en torris kvarn, t ex Clawson modell RE-2.

Del C: Sperma Frys Metod

  1. MARK kapillärrör: Före början, markera 10μl kapillärrör med en labb penna på nivån 3,33 l (dvs 16,7 mm från botten, se figur 1.1.).
  2. BEDÖVA MALE: Placera män (s) i bägaren innehåller MESAB / tricaine utspädda i fiskevatten (recept i "The Zebrafish boken")
  3. DRY FISK: När sövda, lyfta fisken ur bedövning med en plastsked och försiktigt blot fisk torka på en pappershandduk, med särskild uppmärksamhet på torkningen den ventrala sidan. Vatten aktiverar spermierna så det är viktigt att torka runt kloaken. Placera fisken på svamp hållare, ventrala uppåt (bild 1.2). Om området runt analfena är fortfarande fuktig försiktigt torrt med en kimwipe. Var noga med att inte pressa spermier i förtid!
  4. Placera markerade kapillärrör i gummi munnen pipetten adapter som medföljer kapillärrör. Adaptern är en gummislang som har ett munstycke i ena änden och en kapillär hållare på den andra. Alternativt kan kapillärröret vara ansluten till en 50μl Hamilton spruta via en kort bit tygon slang av lämplig diameter.
  5. Placera manliga omfattas och exponera det urogenitala öppningen genom att försiktigt sprida bukfenor isär med slutet av kapillärröret.
  6. SAMLAR spermier: Spruta ut spermier genom att försiktigt stryka sidorna av fisk med mjuk pincett (t.ex. Millipore), eller genom att försiktigt klämma på sidorna av fisk mellan pekfingret och tummen. Samla sperma i kapillärrör som det är utvisades med hjälp av skonsam sugkraft (bild 1.2). Undvik avföring som kan utvisas med sperma.
  7. NORMALISERA SPERMA VOLYM till 3,3 l: Om volymen av spermier når eller överstiger penna märke på kapillärrör (dvs 16,7 mm eller mer), sedan vidare till steg 8. Om spermier volym inte når målet volym, sedan normalisera volymen till penna märket med Freeze medium utan Metanol (Fig. 1,3). Minsta mängd spermier som är acceptabelt varierar med kvaliteten på spermier. Bra sperma är vit och ogenomskinlig. Dålig sperma ser vattnig. I allmänhet accepterar vi som minimum: 1 l bra spermier (eller 1 / 3 mål) och 2 l dåliga spermier (eller 2 / 3 mål). Volymen är nu normaliseras till 3,3 l.
  8. LÄGG frysskyddsmedel för spermierna: Sug upp Frysa medium med Metanol för att den orange markeringen (ca total volym är nu 20 l.. Fig. 1,4). Utvisa spermier och frysskyddsmedel blandning på ren område i ett urglas, med särskild uppmärksamhet för att inte införa bubblor. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned ~ 4 gånger (undvika att införa bubblor).
  9. PLATS 10μl sperma i vardera 2 CRYOVIALS: Pipettera 10 ìl av spermier: frysskyddsmedel lösningen i botten av två separata cryovials som har märkts med relevant information (Fig. 1,5). Rör sig snabbt, mössa flaskor och släppa dem i botten av rumstemperaturen 15 ml Falcon rör-en cryovial / tub. Cap Falcon rör och för in par cryovial innehåller Falcon rör i krossad torris.
  10. FRYS sperma för 20 min. På torris: Torris ska vara i fint pulver form, inte pellets. Rören bör införas i torris djupt nog att endast deras mössor show (Fig. 1,6). För att hålla reda på rören i torris, ge varje par av Falcon rör ett nummer från 1-20 (skrivet på locken) och registrera den tid de går in i torris.
  11. PLATS CRYOVIALS i flytande kväve:. Efter att spermien har varit fryst på torris för 20 min, överföra dem till en flytande kväve-innehållande Dewar kolven. Spermier lagras här tills dags att placera i flytande kväve frys. När du placerar i frysen lådor, placera frysen ruta i ett bad med flytande kväve så att proven inte värmer upp. Använd långa metall tång att återhämta sig flaskor från Dewar kolv och handtag med cryogloves. Alternativt kan cryovials överföras direkt från torr-is i frysen rutan om frysen boxen hålls nedsänkt i flytande kväve i en frigolit behållare.
  12. Förvara cryovials term länge i en kryogenisk flytande kväve frys. För att bibehålla lönsamheten av spermier, är det viktigt att injektionsflaskorna förvarats nedsänkta i flytande kväve. Vår erfarenhet är flaskor som lagras i gasfasen förlorar bärkraft över tid.
    Hastigheten är viktig! Tiden mellan att lägga till frysskyddsmedel och placera spermier flaskor i torris (dvs. steg 6-10) bör inte vara mer än 30 sek.

Del D: In vitro fertilisering Metod med användande av Nedfrysta spermier

Vi finner att detta fungerar bäst med två personer. En person kramar ägg från kvinnor, medan den andra personen tinar spermierna.

  1. Ställ in ett vattenbad till 33 ° C.
  2. Ta bort cryovial från flytande kväve frysen och överföring till flytande kväve som innehåller Dewar kolv tills den ska tina.
  3. Pressa ägg från kvinnor till 35mm plast petriskål. Om möjligt, försöka få 3 klor ägg och kombinera till en skål. Om du inte kan få tre goda kopplingar inom 1 minut av din första kopplingen, sedan vidare till steg 4 (en bra koppling räcker). Definition av god koppling:> 150 jämnt snygg ägg (dvs gulaktig, utan vita skräp tecken på nedbrytning). Håll skål täckt medan spermier är tinade.
  4. Ta bort injektionsflaskan från flytande kväve och ta bort locket. Snabbt Doppa injektionsflaska ~ 1 / 2 väg in i 33 ° C vattenbad i 8-10 sek.
  5. Snabbt lägga till 70 l Hanks rumstemperatur till flaska och blanda genom att pipettera upp och ned. Omedelbart lägga ägg och blanda försiktigt med pipettspetsen.
  6. Utan dröjsmål, aktivera spermier och ägg genom att tillsätta 750 l fisk vatten. Swirl att blanda. Inkubera 5 minuter vid rumstemperatur.
  7. Efter 5 min, fyll skålen med fisk vatten och inkubera maträtt vid 28 ° C. Efter 2-3 timmar, räkna och överföra bördiga embryon till 100mm rätter (50/dish). Räkna infertila ägg så att befruktning frekvens kan fastställas.
  8. Ta väl hand om larverna! För första 5 dagarna, byt vatten dagligen och ta bort döda embryon. Sätt bara larver som har simblåsa i barnkammaren på dag 5.

Del E: representativa resultat

Vi använde detta crypreservation metod för att göra ett bibliotek av 8600 fryst sperma prover för bruka mellan åren 2001 och 2003. Vi har tinade 106 av dessa prover och bestäms deras fertilitet. Fertiliteten är förhållandet mellan livskraftiga embryon produceras i en in vitro-fertilisering delat med det totala antalet ägg som befruktas med frysta spermier. Färsk (ej cryporeserved) spermier normalt har> 95% fertilitet, frysförvarade spermier har mycket lägre fertilitet: i genomsnitt 29% (n = 106 flaskor). Injektionsflaskan till flaskan variation i fruktsamhet är stor, från mindre än 1% till så mycket som 62%. Denna variation representeras av den stora felstaplar representerar standardavvikelse i bild. 2. Men i 106 spermier prover tinas hittills har vi bara en gång upplevt 0% fertiliteten hos både sperma prov och misslyckats med att återvinna motsvarande Tilling mutation.

Genom upptining spermier flaskor från vårt bibliotek under loppet av flera år (2001-2008) har vi funnit att den genomsnittliga fruktsamheten av sperma prover frysta med denna metod ärstabilt över tid (Figur 2). Den genomsnittliga fruktsamheten av fryst sperma prover tinas år 2001 var 23,5% (baserat på 11 sperma prover) och år 2008 var 25% (baserat på 21 sperma prover).

Ett antal andra utredare nu använder det här protokollet spermier frysa i sina labb. Vissa har rapporterat goda framgångar med födelsetal och prov till prov variabilitet liknar det vi har observerat. Andra har enligt uppgift inte att göra detta protokoll arbete i sina händer. Vi tror att sannolika källor till problem är:

  1. Underlåtenhet att använda exakt cryovials eller koniska rör vi har föreslagit i protokollet, vilket leder till en annan hastighet av kyla när i torris;
  2. Underlåtenhet att använda pudrade kolsyreis, vilket leder till en sub-optimal kylning kurs;
  3. Använda hanfiskar med dålig fertilitet: du borde få minst 1 l av spermier från en enda hane. Du kan också testa fertiliteten genom att göra en provrörsbefruktning med färsk sperma, men detta kan vara missvisande eftersom det tar väldigt lite färska spermier att komma nära 100% fertilitet.
  4. Använda undermålig kvalitet ägg i provrörsbefruktning. Använda allt annat än perfekt grepp alltid leder till nära 0% fertilitet, även från sperma prover som faktiskt har bra fertilitet (baserad på fertilitet av de dubbla flaskan).

Figur 1
Figur 1. Schematisk av spermier frysning metodik.

Figur 2
Figur 2. Nedfrysta spermier fruktsamheten förblir stabilt över tiden. Procent fertilitet är antalet livskraftiga embryon produceras i en in vitro-fertilisering delat med det totala antalet ägg som befruktas med fryst sperma. "N" avser antal frysförvarade spermier flaskor vars fertilitet testades i motsvarande år. Felstaplar representerar standardavvikelse. Eftersom varje spermie flaska är från en annan hane, är flaskan till injektionsflaskan variabiliteten.

Discussion

Ett antal andra utredare nu använder det här protokollet spermier frysa i sina labb. Vissa har rapporterat liknande fertilitet och samma prov till prov variation som vi har observerat. Andra har enligt uppgift inte att göra detta protokoll arbete i sina händer. Vi tror att sannolika källor till problem är:

  1. Underlåtenhet att använda exakt cryovials eller koniska rör vi har föreslagit i protokollet, vilket leder till en annan hastighet av kyla när i torris;
  2. Underlåtenhet att använda pudrade kolsyreis, vilket leder till en sub-optimal kylning kurs;
  3. Använda hanfiskar med dålig fertilitet: du borde få minst 1 l av spermier från en enda hane. Du kan också testa fertiliteten genom att göra en provrörsbefruktning med färsk sperma, men detta kan vara missvisande eftersom det tar väldigt lite färska spermier att komma nära 100% fertilitet. Större, mer kraftfullt färgade hanarna ger oftast mer högre kvalitet spermier.
  4. Använda undermålig kvalitet ägg i provrörsbefruktning. Använda allt annat än perfekt grepp alltid leder till nära 0% fertilitet, även från sperma prover som faktiskt har bra fertilitet (baserad på fertilitet av de dubbla flaskan).

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH R01 HG002995 "bruka Zebrafish Genome: en omvänd genetik metoden" för CBM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 μl disposable pipettes Fisher Scientific 22-358697
Watch glasses Pyrex 9985-75
2 ml cryogenic vials Corning 430488
10 x 10 cryoboxes Nalge Nunc international 03-337-7AA
15 ml conical tubes Falcon BD 352099
Tongs Fisher Scientific 10-316B
Cryofreezer Taylor-Wharton K-series For example

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ginsburg, A. S. Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes. J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).
  2. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).
En hög genomströmning Metod för Zebrafish Spermier Frysförvaring och<em> In Vitro</em> Befruktning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Draper, B. W., Moens, C. B. A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (29), e1395, doi:10.3791/1395 (2009).More

Draper, B. W., Moens, C. B. A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (29), e1395, doi:10.3791/1395 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter