Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización

Summary

Este es un protocolo de esperma de alto rendimiento para la criopreservación de pez cebra. Espermatozoides criopreservados utilizando este protocolo tiene un promedio de 25% de la fertilidad en la fertilización in vitro posterior y es estable durante muchos años.

Abstract

Este es un método para la crioconservación de esperma de pez cebra que es una adaptación del método de Harvey (Harvey et al., 1982). Hemos introducido dos cambios en el protocolo original que tanto simplificar el procedimiento y la uniformidad de la muestra aumenta. En primer lugar, normalizar todos los volúmenes de los espermatozoides utilizando medios de congelación que no contiene el crioprotector. Espermatozoides en segundo lugar, se almacenan criopreservadas en crioviales en lugar de los tubos capilares. Las tasas de congelación y descongelación de espermatozoides (δ ° C / hora) son probablemente las dos variables más importantes para el control de este procedimiento. Por esta razón, no pueden sustituir los tubos diferentes a los especificados. Trabajando en equipos de 2, es posible congelar el esperma de 100 hombres por equipo en ~ 2 hrs. Espermatozoides criopreservados utilizando este protocolo tiene un promedio de 25% de la fertilidad (medida como el número de embriones viables generado en una fertilización in vitro, dividido por el número total de huevos fecundados) y esta fertilidad por ciento es estable durante muchos años.

Protocol

Parte A: Soluciones de congelar el semen

1. Ginsberg timbres de pescado (fresco hacer cada 3 días; Ginsburg, 1963)

NOTA: el orden de adición ES IMPORTANTE para prevenir la precipitación

En 450 ml de agua estéril ddH2O disolver:

• NaCl 3,25 g
• KCl 0,125 g
• • 2 H2O CaCl2 0,175 g
  A continuación, añadir:
• NaHCO3 0,10 g

Alcanzar un volumen final de 500 ml con ddH2O estéril y se almacenan a 4 ° C.

2. Medio de congelación (Haga fresco todos los días)

1. SIN metanol
   • Pescado Ginsburg Ringers 10 ml (temperatura ambiente).
   • Leche descremada en polvo 1,5 g
2. Con metanol
   
   NOTA: el orden de adición ES IMPORTANTE para prevenir la precipitación
   
   
   • Pescado Ginsburg Ringers 9 ml (temperatura ambiente).
   • 1 ml de metanol
   • Leche descremada en polvo 1,5 g
   
   Después de montar los medios de congelación, se mezcla bien durante 20 minutos. en un agitador orbital o una mecedora. Antes de usar, alícuota de 1 ml en tubos eppendorf, evitando las burbujas de la superficie.
   

Parte B: Material necesario para la congelación de los espermatozoides

Materiales necesarios para la congelación de los espermatozoides

1. 10 pipetas desechables l (gato Fisherbrand # 22 a 358.697)
2. Vasos de 250 ml para los peces de agua que contiene MESAB / tricaína
3. Vidrios de reloj (gato Pyrex # 9985-75)
4. P20 Pipetman (o equivalente) y consejos
5. Esponja titular de los peces (para mantener hombres al momento de apretar)
6. Microscopio de disección con la iluminación del escenario por encima de
7. Pinza plana (por ejemplo, tipo Millipore)
8. 2,0 ml viales criogénicos (Corning cat # 430488)
9. 10X10 Cajas criogénicas (Nalgene gato # 03-337-7AA)
10. Espuma de poliestireno recipiente con unos 15 cm de ICE1 finamente molidas en seco
11. 15 ml tubos cónicos (Falcon # 352099)
12. Dewar frasco que contiene nitrógeno líquido
13. Pinzas largas (por ejemplo, CMS Fisher gato Cuidado de la Salud # 10-316B)
14. Cryogloves
15. Tanque de recuperación para los hombres
16. Un tubo eppendorf llena de medios de congelación sin metanol
17. Un tubo eppendorf llena de medios de congelación con metanol
18. Cryofreezer (por ejemplo, Taylor-Warton K-series)

¹ Un método simple para la fabricación de hielo seco finamente triturada es envolverlo en una toalla y pulverizar con un martillo. Un método más eficiente es el uso de un molino de hielo seco, por ejemplo, el modelo Clawson RE-2.

Parte C: Método de congelación de esperma

1. MARK tubos capilares: Antes de comenzar, marcar los tubos capilares 10μl con una pluma de laboratorio en el nivel de 3,33 l (es decir, 16,7 mm de fondo, véase la Fig. 1.1.).
2. Anestesiar MASCULINO: masculino Lugar (s) en el vaso que contiene MESAB / tricaína diluido en agua de pescado (ver receta en "El Libro de pez cebra")
3. Secar el pescado: Una vez anestesiado, levantar un pez fuera del anestésico con una cuchara de plástico y suavemente pescado seco en una toalla de papel, prestando especial atención al secado de la parte ventral. El agua activa el esperma lo que es importante que se seque completamente alrededor de la cloaca. Posición de los peces en el titular de la esponja, hasta la parte ventral (Fig. 1.2). Si la región alrededor de la aleta anal está todavía húmeda, ligeramente seco, con una Kimwipe. Tenga cuidado de no apretar el esperma antes de tiempo!
4. Lugar marcado en el tubo capilar adaptador de goma pipetear con la boca que se incluye con los tubos capilares. El adaptador es un tubo de goma que tiene una boquilla en un extremo y un soporte capilar en el otro. Alternativamente, el tubo capilar puede ser conectado a una jeringa Hamilton 50μl a través de un pequeño trozo de tubo Tygon con el diámetro apropiado.
5. Lugar en el ámbito masculino y exponer la apertura urogenital con cuidado la difusión de las aletas pélvicas separadas usando el extremo del tubo capilar.
6. Juntar esperma: expulsar esperma por acariciar suavemente los lados del pescado con unas pinzas suaves (por ejemplo, Millipore), o apretando suavemente los lados de los peces entre el dedo índice y el pulgar. Recoger los espermatozoides en un tubo capilar, ya que es expulsado con una suave succión (Fig. 1.2). Evitar que las heces pueden ser expulsados ​​con el esperma.
7. Normalizar el volumen de esperma A l 3.3: Si el volumen de esperma alcanza o sobrepasa la marca pluma en tubo capilar (es decir, 16,7 mm o más), continúe con el paso 8. Si el volumen de esperma no llegue a volumen de destino, normalizar el volumen de la marca pluma usando Medio de congelar sin metanol (Fig. 1.3). Mínima cantidad de esperma que es aceptable varía con la calidad de los espermatozoides. Espermatozoide bueno es blanco y opaco. Pobre de la esperma se ve aguada. En general, se acepta como mínimos: 1 l de esperma bien (o 1 / 3 de destino) y 2 l de esperma pobres (o 2 / 3 de destino). Volumen se ha normalizado a 3,3 l.
8. AÑADIR crioprotector a los espermatozoides: Aspire medio de congelación con Metanol para la marca naranja (aprox. volumen total es ahora de 20 l;. Figura 1.4). Expulsar a la mezcla de esperma y crioprotector en la zona limpia de un vidrio de reloj, con especial atención a no introducir burbujas. Mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo ~ 4 veces (evitar la introducción de burbujas).
9. LUGAR 10μl esperma en cada uno de 2 crioviales: Introducir 10 l de los espermatozoides: la solución de crioprotectores en la parte inferior de dos crioviales separadas que han sido etiquetados con la información relevante (Figura 1.5). Moviéndose rápidamente, los viales de la tapa y colóquelos en la parte inferior de la temperatura ambiente de 15 ml tubos Falcon, uno criovial / tubo. Cap Falcon tubo e insertar el par de criovial que contienen los tubos Falcon en hielo seco triturado.
10. Congelar el esperma durante 20 minutos. En hielo seco: El hielo seco debe ser en forma de polvo fino, no pellets. Los tubos se insertan en el hielo seco lo suficientemente profundo que sólo muestran sus límites (Fig. 1.6). Con el fin de realizar un seguimiento de los tubos en hielo seco, dar a cada par de tubos Falcon de un número de 1-20 (escrita en las tapas) y registrar el momento en que entra en el hielo seco.
11. LUGAR crioviales en nitrógeno líquido:. Después de que el esperma ha sido congelado en hielo seco durante 20 minutos, transferirlos a un átomo de nitrógeno líquido que contiene frasco de Dewar. Los espermatozoides se almacenan aquí hasta el momento de colocar en el congelador de nitrógeno líquido. Al colocar en las cajas del congelador, coloque el cuadro congelador en un baño de nitrógeno líquido para que las muestras no se calientan. Utilice pinzas largas de metal para recuperar frascos de vaso Dewar y manejar con cryogloves. Por otra parte, crioviales se pueden transferir directamente de hielo seco en el congelador si el congelador se mantienen sumergidas en nitrógeno líquido en un recipiente de espuma de poliestireno.
12. Crioviales almacenar a largo plazo en un congelador de nitrógeno líquido criogénico. Para mantener la viabilidad de los espermatozoides, es importante que los viales se almacenan sumergidos en nitrógeno líquido. En nuestra experiencia, los frascos almacenados en la fase de vapor pierden su viabilidad en el tiempo.
    La velocidad es importante! El tiempo entre la adición del crioprotector y la colocación de los viales de esperma en hielo seco (es decir, los pasos 6-10) no debe ser mayor de 30 seg.
    

Parte D: En el método de fertilización in vitro con esperma criopreservados

Nos parece que esto funciona mejor con dos personas. Una persona aprieta los huevos de las hembras, mientras que la otra persona se descongela el semen.

1. Establecer un baño de agua a 33 ° C.
2. Quitar criovial del congelador de nitrógeno líquido y la transferencia de nitrógeno líquido que contiene frasco Dewar hasta que esté listo para descongelar.
3. Apriete los huevos de las hembras en el plato de plástico de 35 mm de Petri. Si es posible, tratar de obtener tres nidadas de huevos y se combinan en un plato. Si usted no puede conseguir tres garras bien dentro de 1 minuto de su primera nidada, a continuación, proceder al paso 4 (un embrague bueno es suficiente). Definición de embrague bien:> 150 huevos en busca de manera uniforme bonito (amarillo, es decir, sin residuos blancos indicador de una degradación). Mantenga plato cubierto mientras que el esperma descongelado.
4. Retire el vial de nitrógeno líquido y se quite la tapa. Vial rápidamente sumergirse ~ 1 / 2 camino a 33 ° C baño de agua de 8.10 seg.
5. Añadir rápidamente a temperatura ambiente 70 l Hanks al vial y mezclar pipeteando arriba y hacia abajo. Inmediatamente agrega a los huevos y mezclar suavemente con la punta de la pipeta.
6. Sin demora, activar esperma y los óvulos mediante la adición de 750 peces de agua l. Agitar para mezclar. Incubar 5 min a temperatura ambiente.
7. Después de 5 minutos, llenar con agua los peces plato y plato se incuba a 28 ° C. Después de 2-3 horas, el recuento y la transferencia de embriones fértiles a los platos de 100 mm (50/dish). Conteo de huevos infértiles para que la frecuencia de fertilización se puede determinar.
8. Tenga mucho cuidado de las larvas! Durante los primeros 5 días, el cambio diario del agua y eliminar embriones muertos. Ponga las larvas sólo tienen vejigas natatorias en vivero en el día 5.

Parte E: Resultados Representante

Hemos utilizado esta metodología crypreservation para hacer una biblioteca de 8.600 muestras de semen congelado para la labranza, entre los años 2001 y 2003. Hemos descongelado 106 de estas muestras y se determinó su fertilidad. La fertilidad es la proporción de embriones viables producidos en una fertilización in vitro, dividido por el número total de huevos que fueron fecundados con el esperma congelado. Fresco (no cryporeserved) esperma normalmente tiene la fertilidad> 95%; espermatozoides criopreservados ha fertilidad mucho más baja: un promedio de 29% (n = 106 viales). La variabilidad de vial a vial de la fertilidad es muy grande, que van desde menos del 1% hasta un máximo de 62%. Esta variabilidad está representada por las barras de error grande que representa la desviación estándar de la figura. 2. Sin embargo, en 106 muestras de semen descongelado hasta la fecha sólo hemos experimentado una vez la fertilidad del 0% en las muestras de esperma de ambos y no logró recuperarse de la mutación labranza correspondiente.

Por el deshielo frascos de esperma de la biblioteca a lo largo de varios años (2001-2008) se ha encontrado que el promedio de fertilidad de las muestras de esperma congelado por este método sigue siendoestable en el tiempo (Fig. 2). La fecundidad promedio de las muestras de esperma congelado se descongela en 2001 fue del 23,5% (basado en 11 muestras de semen) y en 2008 fue del 25% (basado en 21 muestras de semen).

Un número de otros investigadores están usando este protocolo de congelación de esperma en sus laboratorios. Algunos han reportado buenos resultados con las tasas de fecundidad y la variabilidad de la muestra a la muestra similar a lo que hemos observado. Otros no han logrado convencer para que este protocolo de trabajo en sus manos. Creemos que las posibles fuentes de problemas son:

1. Si no se utiliza la crioviales exacta o tubos cónicos que hemos sugerido en el protocolo, lo que lleva a un ritmo diferente de la hipotermia cuando en hielo seco;
2. Si no se utiliza hielo seco en polvo, dando lugar a una velocidad de enfriamiento debajo del nivel óptimo;
3. Utilizando los peces machos de baja fertilidad: usted debe obtener al menos 1 l de esperma de un macho. También puede probar la fertilidad masculina haciendo una fertilización in vitro con semen fresco, sin embargo esto puede ser engañoso ya que tiene muy poco semen fresco para obtener casi el 100% de fertilidad.
4. Utilizando debajo de los estándares de calidad en los huevos de la fecundación in vitro. Usando nada más que perfecto garras siempre lleva a cerca de 0% de fertilidad, aunque a partir de muestras de semen que en realidad tienen una buena fertilidad (sobre la base de la fertilidad del vial duplicado).

Figura 1. Esquema de la metodología de congelar el semen.

Figura 2. Fertilidad del semen criopreservadas se mantiene estable en el tiempo. Fertilidad por ciento es el número de embriones viables producidos en una fertilización in vitro, dividido por el número total de huevos que fueron fecundados con el esperma congelado. "N" se refiere al número de viales de semen crioconservado cuya fertilidad ha sido probado en el año correspondiente. Las barras de error representan la desviación estándar. Dado que cada vial de esperma es de un hombre diferente, vial a vial variabilidad que se observa.

Discussion

Un número de otros investigadores están usando este protocolo de congelación de esperma en sus laboratorios. Algunos han informado de la fertilidad similar y la misma muestra de la muestra de la variabilidad que hemos observado. Otros no han logrado convencer para que este protocolo de trabajo en sus manos. Creemos que las posibles fuentes de problemas son:

1. Si no se utiliza la crioviales exacta o tubos cónicos que hemos sugerido en el protocolo, lo que lleva a un ritmo diferente de la hipotermia cuando en hielo seco;
2. Si no se utiliza hielo seco en polvo, dando lugar a una velocidad de enfriamiento debajo del nivel óptimo;
3. Utilizando los peces machos de baja fertilidad: usted debe obtener al menos 1 l de esperma de un macho. También puede probar la fertilidad masculina haciendo una fertilización in vitro con semen fresco, sin embargo esto puede ser engañoso ya que tiene muy poco semen fresco para obtener casi el 100% de fertilidad. Más grandes, los machos con mayor fuerza de color suelen dar más espermatozoides de mayor calidad.
4. Utilizando debajo de los estándares de calidad en los huevos de la fecundación in vitro. Usando nada más que perfecto garras siempre lleva a cerca de 0% de fertilidad, aunque a partir de muestras de semen que en realidad tienen una buena fertilidad (sobre la base de la fertilidad del vial duplicado).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μl disposable pipettes	Fisher Scientific	22-358697
Watch glasses	Pyrex	9985-75
2 ml cryogenic vials	Corning	430488
10 x 10 cryoboxes	Nalge Nunc international	03-337-7AA
15 ml conical tubes	Falcon BD	352099
Tongs	Fisher Scientific	10-316B
Cryofreezer	Taylor-Wharton	K-series	For example