Une méthode à haut débit pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre et de In Vitro La fertilisation

Summary

Ceci est un protocole de haut débit de cryoconservation des spermatozoïdes de poisson zèbre. Le sperme cryoconservés en utilisant ce protocole a une moyenne de fertilité de 25% de fécondation in vitro ultérieure et est stable depuis de nombreuses années.

Abstract

C'est une méthode pour la cryoconservation du sperme de poisson zèbre qui est une adaptation de la méthode Harvey (Harvey et al., 1982). Nous avons introduit deux modifications au protocole original que les deux rationaliser la procédure et l'uniformité de l'échantillon augmente. Premièrement, nous normalisons tous les volumes de sperme à l'aide des médias de congélation qui ne contient pas l'cryoprotecteur. Deuxièmement, les spermatozoïdes cryopréservés sont stockés dans des cryotubes au lieu de tubes capillaires. Le taux de spermatozoïdes gel et de dégel (δ ° C / heure) sont probablement les deux variables les plus critiques à contrôler dans cette procédure. Pour cette raison, ne pas remplacer les tubes différents de ceux spécifiés. Travaillant en équipes de 2, il est possible de congeler le sperme de 100 hommes par équipe dans ~ 2 heures. Le sperme cryoconservés en utilisant ce protocole a une moyenne de fertilité de 25% (mesurée par le nombre d'embryons viables généré en une fécondation in vitro, divisé par le nombre total d'œufs fécondés) et cette fertilité pour cent est stable depuis de nombreuses années.

Protocol

Partie A: Solutions congélation du sperme

1. Ringers poisson Ginsberg (Faire frais tous les 3 jours; Ginsburg, 1963)

REMARQUE: l'ordre d'ajout est important de prévenir PRÉCIPITATION

Dans 450 ml stériles ddH2O dissoudre:

• NaCl 3,25 g
• KCl 0,125 g
• CaCl2 • 2 H2O 0,175 g
  Puis ajouter:
• NaHCO3 0,10 g

Amener le volume final à 500 ml avec ddH2O stériles et conserver à 4 ° C.

2. Milieu de congélation (Faire frais du jour)

1. Sans méthanol
   • Poissons Ginsburg Ringers 10 ml (température ambiante).
   • Lait écrémé en poudre 1,5 g
2. Avec du méthanol
   
   REMARQUE: l'ordre d'ajout est important de prévenir PRÉCIPITATION
   
   
   • Poissons Ginsburg Ringer 9 ml (température ambiante).
   • 1 ml de méthanol
   • Lait écrémé en poudre 1,5 g
   
   Après le montage des médias de congélation, bien mélanger pendant 20 min. sur agitateur orbital ou de bascule. Avant d'utiliser, dans la partie aliquote 1 ml tubes Eppendorf, en évitant les bulles de surface.
   

Partie B: Matériel nécessaire pour la congélation du sperme

Matériel nécessaire pour la congélation du sperme

1. 10 ul pipettes jetables (chat Fisherbrand # 22-358697)
2. Béchers de 250ml d'eau contenant des poissons MESAB / tricaïne
3. verres de montre (chat Pyrex # 9985-75)
4. P20 Pipetman (ou équivalent) et des conseils
5. Détenteur de poissons éponge (pour tenir hommes tout en serrant)
6. Dissection microscope avec éclairage de la scène ci-dessus
7. Pince plate (type Millipore, par exemple)
8. 2.0ml flacons cryogéniques (Cat # 430488 Corning)
9. 10X10 cryoboîtes (Nalgene cat # 03-337-7AA)
10. Styromousse récipient rempli de ~ 15 cm de ICE1 sèche finement broyées
11. 15 ml conique tubes (Falcon # 352099)
12. Vase Dewar contenant de l'azote liquide
13. Pince à long terme (par exemple CMS Fisher chat Soins de santé # 10-316B)
14. Cryogloves
15. Réservoir de récupération pour les hommes
16. Un tube Eppendorf remplis avec les médias de congélation sans méthanol
17. Un tube Eppendorf remplis avec les médias de congélation avec du méthanol
18. Cryofreezer (par exemple, Taylor-Warton série K)

¹ Une méthode simple pour faire de la glace finement broyées à sec est de l'envelopper dans une serviette et pulvériser avec un marteau. Une méthode plus efficace est d'utiliser un broyeur de glace carbonique, par exemple Clawson modèle RE-2.

Partie C: méthode de congélation de sperme

1. MARK TUBES CAPILLAIRES: Avant de commencer, marquer les tubes capillaires 10 ul avec un stylo de laboratoire au niveau de 3,33 ul (c'est à dire 16,7 mm du bas, voir Figure 1.1.).
2. Anesthésier MALE: masculin Lieu (x) dans le bécher contenant MESAB / tricaïne dilué dans l'eau les poissons (recette dans «Le Livre de poisson zèbre»)
3. Poisson séché: Une fois anesthésié, ascenseur poisson hors de l'anesthésie à l'aide d'une cuillère en plastique et éponger délicatement les poissons à sec sur une serviette en papier, en accordant une attention particulière au séchage de la face ventrale. L'eau actionne le sperme il est donc important de sécher complètement autour du cloaque. Position sur les poissons porte-éponge, jusqu'à la face ventrale (Fig. 1.2). Si la région autour de la nageoire anale est encore humide, doucement à sec avec un Kimwipe. Prenez soin de ne pas presser le sperme prématurément!
4. Placez marqués tube capillaire dans un adaptateur en caoutchouc pipeter à la bouche qui est inclus avec les tubes capillaires. L'adaptateur est un tuyau en caoutchouc qui a une embouchure sur une extrémité et un porte-capillaire sur l'autre. Alternativement, le tube capillaire peut être reliée à une seringue Hamilton 50 pl via un petit bout de tube Tygon de diamètre approprié.
5. Placer sous le mâle de la portée et d'exposer l'ouverture urogénitale par attentivement la propagation des nageoires pelviennes en dehors en utilisant l'extrémité du tube capillaire.
6. Recueil de sperme: Expulser spermatozoïdes par caresser doucement les côtés du poisson avec des pinces lisses (par exemple, Millipore), ou en pressant doucement les côtés du poisson entre votre index et le pouce. Recueillir le sperme dans le tube capillaire comme il est expulsé en utilisant une aspiration douce (Fig. 1.2). Evitez les matières fécales qui peuvent être expulsés avec le sperme.
7. Normaliser le volume de sperme à 3,3 ul: Si le volume de sperme atteint ou dépasse la marque stylo sur tube capillaire (soit 16,7 mm ou plus), puis passez à l'étape 8. Si le volume de sperme n'atteint pas le volume cible, puis de normaliser le volume de marquer stylo en utilisant le milieu geler sans méthanol (figure 1.3). Montant minimum du sperme qui est acceptable varie avec la qualité du sperme. Bonne spermatozoïde est blanche et opaque. Pauvre de sperme ressemble larmoyants. En général, nous acceptons que des minimums: 1 spermatozoïde ul bon (ou 1 / 3 cible) et 2 ul de sperme pauvre (ou 2 / 3 cible). Le volume est maintenant normalisée à 3,3 pi.
8. AJOUTER cryoprotecteur aux spermatozoïdes: Aspirez moyen de congélation avec Ml'éthanol pour la marque orange (approx. volume total est maintenant de 20 ul;. Fig 1.4). Expulser le mélange de sperme et cryoprotecteur sur zone propre d'un verre de montre, en accordant une attention particulière à ne pas introduire de bulles. Mélanger doucement par aspiration et refoulement ~ 4 fois (éviter l'introduction de bulles).
9. LIEU 10 ul sperme dans chacune des 2 cryotubes: pipette 10 ul de sperme: solution cryoprotectrice dans le fond de deux cryotubes distincts qui ont été étiquetés avec des informations pertinentes (Fig. 1.5). Déplacement rapide, flacons capuchon et déposez-les dans le bas de la température ambiante 15 ml tubes Falcon-un cryovial / tube. Cap Falcon tube et insérer la paire de tubes Falcon cryovial contenant en glace sèche écrasée.
10. Congeler du sperme pendant 20 min. Sur glace sèche: La glace sèche doit être sous forme de poudre fine, pas de pastilles. Les tubes doivent être insérées dans la glace sèche assez profonde que seuls leurs bouchons montrent (fig. 1.6). Afin de garder une trace de tubes dans la glace sèche, donner à chaque paire de tubes Falcon un numéro de 1-20 (écrit sur les bouchons) et enregistrer le temps ils vont dans la glace sèche.
11. Cryotubes placer dans l'azote liquide:. Après le sperme a été congelé sur glace sèche pendant 20 minutes, les transférer sur un contenant de l'azote liquide vase Dewar. Le sperme est stocké ici jusqu'à ce que le temps de placer au congélateur azote liquide. Lorsque vous placez dans les boîtes de congélation, coffre congélateur placer dans un bain d'azote liquide afin que les échantillons ne chauffent pas. Utiliser des pinces métalliques longs à récupérer les flacons de vase Dewar et manipuler avec cryogloves. Alternativement, cryotubes peuvent être transférées directement à partir de la glace sèche dans la boîte congélateur si la boîte du congélateur est maintenue immergée dans l'azote liquide dans un récipient en polystyrène expansé.
12. Cryotubes magasin à long terme dans un congélateur à azote liquide cryogénique. Afin de maintenir la viabilité des spermatozoïdes, il est important que les flacons sont conservés immergés dans l'azote liquide. Dans notre expérience, flacons stockés dans la phase vapeur perdent leur viabilité dans le temps.
    La vitesse est importante! Le temps entre l'ajout du cryoprotecteur et en plaçant les flacons de sperme dans la glace sèche (ie les étapes 6-10) ne devrait pas être plus de 30 sec.
    

Partie D: Méthode de fécondation in vitro avec le sperme cryoconservés

Nous constatons que cela fonctionne mieux avec deux personnes. Une personne serre les œufs des femelles tandis que l'autre personne dégèle le sperme.

1. Définissez un bain d'eau à 33 ° C.
2. Retirer du congélateur cryovial azote liquide et le transfert de l'azote liquide contenant vase Dewar jusqu'au moment de dégel.
3. Presser les oeufs des femelles dans les boîtes de Pétri 35mm en plastique. Si possible, essayez d'obtenir trois couvées d'œufs et de combiner en un seul plat. Si vous ne pouvez pas obtenir trois embrayages bonne au sein de 1 min de votre premier embrayage, puis passez à l'étape 4 (un embrayage bonne est suffisant). Définition de l'embrayage bonne:> 150 oeufs à la recherche de manière uniforme belle (jaunâtre-dire, sans aucun débris blancs indique une dégradation). Gardez plat couvert pendant que le sperme est décongelé.
4. Retirez le flacon de l'azote liquide et enlever le capuchon. Flacon rapidement plonger ~ 1 / 2 chemin dans 33 ° C bain d'eau pendant 8-10 sec.
5. Ajouter rapidement 70 ul température ambiante Hanks au flacon et mélanger par pipetage de haut en bas. Immédiatement ajouter les oeufs et mélanger délicatement avec la pointe de pipette.
6. Sans plus tarder, activer le sperme et les oeufs en ajoutant 750 poissons d'eau ul. Faire tourbillonner pour mélanger. Incuber 5 min à température ambiante.
7. Après 5 min, remplissez-vaisselle avec l'eau du poisson et un plat incuber à 28 ° C. Après 2-3 heures, le comte et le transfert d'embryons fertiles à des plats 100mm (50/dish). Comptez oeufs stériles de telle sorte que la fréquence de fertilisation peut être déterminée.
8. Prenez bien soin des larves! Pour les 5 premiers jours, changer l'eau tous les jours et retirer les embryons morts. Mettez les larves qui ont seuls la vessie natatoire en pépinière sur 5 jours.

Partie E: Résultats Représentant

Nous avons utilisé cette méthodologie crypreservation de faire une bibliothèque de 8600 échantillons de sperme congelé pour labourer entre les années 2001 et 2003. Nous avons décongelés 106 de ces échantillons et déterminé leur fertilité. La fertilité est le ratio des embryons viables produites dans une fécondation in vitro, divisé par le nombre total d'oeufs qui ont été fécondés avec le sperme congelé. Frais (non cryporeserved) spermatozoïde a généralement la fertilité> 95%; de sperme cryoconservés a fécondité beaucoup plus faible: une moyenne de 29% (n = 106 flacons). La variabilité flacon à flacon de fécondité est élevé, allant de moins de 1% à aussi haut que 62%. Cette variabilité est représentée par les barres d'erreur importante représentant l'écart type dans la Fig. 2. Cependant, dans 106 échantillons de sperme décongelé à jour, nous avons seulement une fois expérimenté la fertilité 0% dans deux échantillons de sperme et a échoué à récupérer la mutation TILLING correspondant.

Par le dégel des flacons de sperme provenant de notre bibliothèque au cours de plusieurs années (2001-2008), nous avons constaté que la fécondité moyenne des échantillons de sperme congelé par cette méthode restestables au fil du temps (Fig. 2). La fécondité moyenne des échantillons de sperme congelé dégelé en 2001 était de 23,5% (basé sur 11 échantillons de sperme) et en 2008 était de 25% (basé sur 21 échantillons de sperme).

Un certain nombre d'autres chercheurs sont maintenant en utilisant ce protocole de congélation de sperme dans leurs laboratoires. Certains ont rapporté de bons résultats avec des taux de fécondité et de l'échantillon à l'échantillon une variabilité similaire à ce que nous avons observés. D'autres auraient échoué à faire de ce protocole de travail dans leurs mains. Nous croyons que des sources probables de problèmes sont les suivants:

1. Ne pas utiliser les cryotubes exacte ou tubes coniques, nous avons suggéré dans le protocole, conduisant à un taux différent de refroidissement lorsque dans la glace sèche;
2. La non utilisation de poudre de glace sèche, conduisant à une vitesse de refroidissement sous-optimale;
3. En utilisant les poissons mâles à la fertilité médiocre: vous devriez obtenir au moins 1 ul de sperme à partir d'un seul mâle. Vous pouvez également tester la fertilité masculine en faisant une fécondation in vitro avec le sperme frais, mais cela peut être trompeur, car il prend très peu de sperme frais de s'approcher de la fertilité de 100%.
4. En utilisant des oeufs de qualité inférieure aux normes dans la fécondation in vitro. Utiliser tout sauf embrayages parfaite conduit toujours à proximité de la fertilité de 0%, même à partir d'échantillons de sperme qui ont réellement une bonne fertilité (basé sur la fertilité de la fiole en double).

Figure 1. Schéma de la méthodologie de la congélation du sperme.

Figure 2. Fertilité des spermatozoïdes cryoconservés reste stable au fil du temps. La fertilité pour cent est le nombre d'embryons viables produites dans une fécondation in vitro, divisé par le nombre total d'oeufs qui ont été fécondés avec le sperme congelé. "N" désigne le nombre de flacons de sperme cryoconservés dont la fertilité a été testé dans l'année correspondante. Les barres d'erreur représentent l'écart-type. Comme chaque flacon de sperme est d'un mâle différent, flacon à flacon variabilité est observée.

Discussion

Un certain nombre d'autres chercheurs sont maintenant en utilisant ce protocole de congélation de sperme dans leurs laboratoires. Certains ont signalé la fertilité similaires et le même échantillon à l'échantillon que nous avons la variabilité observée. D'autres auraient échoué à faire de ce protocole de travail dans leurs mains. Nous croyons que des sources probables de problèmes sont les suivants:

1. Ne pas utiliser les cryotubes exacte ou tubes coniques, nous avons suggéré dans le protocole, conduisant à un taux différent de refroidissement lorsque dans la glace sèche;
2. La non utilisation de poudre de glace sèche, conduisant à une vitesse de refroidissement sous-optimale;
3. En utilisant les poissons mâles à la fertilité médiocre: vous devriez obtenir au moins 1 ul de sperme à partir d'un seul mâle. Vous pouvez également tester la fertilité masculine en faisant une fécondation in vitro avec le sperme frais, mais cela peut être trompeur, car il prend très peu de sperme frais de s'approcher de la fertilité de 100%. Plus grand, plus robuste mâles colorés donnent généralement le sperme de qualité plus élevés.
4. En utilisant des oeufs de qualité inférieure aux normes dans la fécondation in vitro. Utiliser tout sauf embrayages parfaite conduit toujours à proximité de la fertilité de 0%, même à partir d'échantillons de sperme qui ont réellement une bonne fertilité (basé sur la fertilité de la fiole en double).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μl disposable pipettes	Fisher Scientific	22-358697
Watch glasses	Pyrex	9985-75
2 ml cryogenic vials	Corning	430488
10 x 10 cryoboxes	Nalge Nunc international	03-337-7AA
15 ml conical tubes	Falcon BD	352099
Tongs	Fisher Scientific	10-316B
Cryofreezer	Taylor-Wharton	K-series	For example