Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme

Summary

Bu zebrafish yüksek verimlilik için bir sperm dondurulması protokol. Sperm bu protokolü kullanarak,% 25, ​​sonraki vitro fertilizasyon doğurganlık ortalama ve uzun yıllardır istikrarlı dondurularak saklanabilir.

Abstract

Bu Harvey yöntemi (Harvey ve ark, 1982) bir uyarlaması olan zebrafish sperm dondurulması için bir yöntem. Biz de prosedür düzene ve örnek bütünlüğü artırmak, orijinal protokol iki değişiklik girmiştik. İlk olarak, sperm hacimleri dölveriminin içermez donma medyayı kullanarak tüm normalleştirmek. İkincisi, soğukta saklanan sperm kılcal tüpler yerine cryovials saklanır. (Δ ° C ​​/ saat) sperm dondurma ve çözme oranları muhtemelen bu yordamı kontrol etmek için iki en kritik değişkenler. Bu nedenle, belirtilen bu farklı tüpler yerine geçmez. 2 bu takımlar halinde çalışma ~ 2 saat içinde takım başına 100 erkeklerin sperm dondurmak mümkün. Sperm bu protokolü kullanarak, ortalama% 25 doğurganlık (in vitro fertilizasyon döllenmiş yumurta toplam sayısına bölünmesiyle oluşturulan canlı embriyo sayısı olarak ölçülen) ve bu yüzde doğurganlık, uzun yıllardır istikrarlı dondurularak saklanabilir.

Protocol

Bölüm A: Sperm Dondurma Çözümleri

1. Ginsberg Balık Ringers (her 3 günde bir, taze olun; Ginsburg, 1963)

NOT: EK SİPARİŞ YAĞIŞ ÖNLEMEK İÇİN ÖNEMLİ

450 ml steril ddH2O çözülür:

• NaCl 3,25 g
• KCl 0.125 g
• CaCl2 • 2 H2O 0,175 g
  Daha sonra ekleyin:
• NaHCO3 0.10 g

4 steril ddH2O ve mağaza ° C ile son hacim 500 ml getirin

2. Donma Orta (taze günlük yapın)

1. Metanol OLMADAN
   • Ginsburg Balık 10 ml Ringers (oda sıcaklığında).
   • Toz Yağsız Süt 1.5 gram
2. Metanol ile
   
   NOT: EK SİPARİŞ YAĞIŞ ÖNLEMEK İÇİN ÖNEMLİ
   
   
   • Ginsburg Balık 9 ml (oda sıcaklığında) Ringers
   • Metanol 1 ml
   • Toz Yağsız Süt 1,5 g
   
   Dondurma medya montaj sonra, 20 dakika süreyle iyice karıştırın. orbital çalkalayıcı ya da rocker. Kullanmadan önce, içine kısım 1 ml Eppendorf tüpleri, yüzeyinde kabarcıklar kaçınarak.
   

Bölüm B: sperm dondurmak için gerekli malzemeler

Sperm dondurma için gerekli malzemeler

1. 10 ul tek kullanımlık pipetler (Fisherbrand kedi # 22-358.697)
2. MESAB / Tricaine içeren balık su için 250 ml bardak
3. izlemek camlar (Pyrex kedi # 9985-75)
4. P20 Pipetman (veya eşdeğeri) ve ipuçları
5. Sünger balık tutucu (sıkma sırasında erkek tutun)
6. Yukarıdaki sahne aydınlatma ile mikroskop Diseksiyon
7. Düz forseps (örneğin Millipore tipi)
8. 2.0ml kriyojenik şişeleri (Corning kedi # 430.488)
9. 10X10 cryoboxes (Nalgene kedi # 03-337-7AA)
10. Strafor konteyner ile dolu ince ezilmiş kuru ice1 ~ 15 cm
11. 15 ml konik tüpler (Falcon # 352.099)
12. Sıvı azot içeren Dewar şişesi
13. Uzun maşa (mesela, CMS Fisher Sağlık Bakım kedi # 10-316B)
14. Cryogloves
15. Erkekler için Kirli su tankı
16. Bir Eppendorf tüp metanol olmadan dondurma medya ile dolu
17. Bir Eppendorf tüp metanol ile dondurma medya ile dolu
18. Cryofreezer (örneğin Taylor-Warton K-serisi)

¹ ince ezilmiş kuru buz yapmak için basit bir yöntem, bir havlu sarın ve bir çekiç ile ezebileceği . Daha etkili bir yöntem, bir kuru buz değirmeni, örneğin Clawson model RE-2 kullanmaktır.

Bölüm C: Sperm Dondurma Yöntemi

1. Kapiller BORULAR MARK: başlangıcına önce, (yani 16.7 mm alttan bkz. Şekil 1.1.) 3,33 ul düzeyinde bir laboratuar kalem ile 10μl kılcal tüpler işareti.
2. ERKEK uyutmak MESAB / tricaine (reçete) "Zebra balığı Kitap" balık su içinde seyreltilmesi içeren behere koyun erkek (ler):
3. KURU BALIK: Bir kez anestezi, anestezik bir plastik kaşık kullanarak balık kaldırın ve yavaşça ventral tarafında kuruma özel bir dikkat, bir kağıt havlu üzerine kuru balık blot . Lağım etrafında iyice kuruması için önemli böylece su sperm harekete geçirir. Sünger tutucu pozisyon balık, ventral yüzü yukarı (Şekil 1.2). Anal yüzgecinin etrafında bölgede hala bir kimwipe hafifçe kuru, nemli ise. Sperm erken sıkmak değil dikkat edin!
4. Place kılcal tüpleri ile birlikte lastik ağız pipet adaptörü kılcal tüp kutladı. Adaptörü, bir ucunda ağızlık ve diğer bir kılcal sahibi olan bir lastik hortum. Alternatif olarak, kılcal tüp, uygun çaplı Tygon boru kısa bir parça ile 50μl Hamilton şırınga bağlı olabilir.
5. Place kapsamında erkek ve kılcal tüp sonuna dikkatle kullanarak dışında pelvik yüzgeçler yayılmasını ürogenital açılış maruz.
6. SPERM TOPLAR: At pürüzsüz forseps (örneğin Millipore) balık tarafı hafifçe okşayarak tarafından sperm, ya da işaret parmağı ve başparmak arasında balık tarafını hafifçe sıkarak. Nazik vakum (Şekil 1.2) kullanılarak atılır kılcal tüp sperm toplayın. Sperm ile sınırdışı edilebilir dışkı kaçının.
7. Ul 3.3 İÇİN SPERM HACMİ normale hacmi, sperm ulaştığında ya da kapiller tüp (yani 16.7 mm veya daha fazla) kalem işareti aşarsa, daha sonra 8. adıma geçin . Sperm hacmi hedef hacim ulaşamazsa, daha sonra kalem işaretine Metanol (Şekil 1.3) OLMADAN Freeze Orta kullanarak hacim normalleştirmek. Kabul edilebilir minimum miktar sperm sperm kalitesi değişir. İyi sperm beyaz ve opak. Düşük sperm sulu görünüyor. 1 ul iyi sperm (ya da 1 / 3 hedef) ve 2 ul sperm (ya da 2 / 3 hedef): Genel olarak, asgari olarak kabul. Cilt şimdi 3.3 ul normalize.
8. SPERM İÇİN dölveriminin ADD: M İLE Donma Orta Suckturuncu işareti (Şekil 1.4 yaklaşık toplam hacmi 20 ul) etanol. Kabarcıkları tanıtmak için özel bir dikkat, bir saat camı temiz bir alan üzerine sperm ve dölveriminin karışımı boşaltınız. Yukarı ve aşağı pipetleme ~ 4 kez (kabarcıkları tanıtan kaçının) hafifçe karıştırın.
9. 10μl SPERM INTO 2 CRYOVIALS HER YERİ: sperm Pipet 10 ul ilgili bilgileri (Şekil 1.5) etiketli iki ayrı cryovials dibine dölveriminin çözüm. Hızlı, kap şişeleri taşıma ve oda sıcaklığında 15 ml Falcon tüpleri bir arada cryovial / tüp dibine bırakın. Cap Falcon tüp ve ezilmiş kuru buz içine cryovial içeren Falcon tüpleri çifti eklemek.
10. 20 MIN İÇİN SPERM FREEZE. KURU BUZ ON: Kuru buz, ince toz şeklinde değil, pelet olmalıdır . Tüpler, sadece kapakları (Şekil 1.6) yeterince derin kuru buz takılı olmalıdır. Kuru buz tüp takip etmek amacıyla, Falcon tüpleri her çift 1-20 (kapaklar üzerindeki yazılı) bir numara vermek ve kuru buz gitmek zamanların rekoru.
11. SIVI AZOT INTO YERİ CRYOVIALS: 20 dakika süreyle kuru buz dondurulmuş sperm edildikten sonra, sıvı azot içeren Dewar balon aktarabilirsiniz. Sperm sıvı azot dondurucu içine yerleştirmek saatine kadar burada saklanır. örnekleri ısınmasına kalmamak için sıvı nitrojen banyo dondurucu kutulara yerleştirerek, dondurucu kutusu. Dewar balon şişeleri kurtarmak ve cryogloves başa uzun metal maşa kullanın. Alternatif olarak, eğer dondurucu kutusu, plastik bir kap içinde sıvı azot içinde batırılır tutulur cryovials dondurucu kutusunun içine kuru buz doğrudan transfer edilebilir.
12. Kriyojenik sıvı azot dondurucuda saklayın cryovials uzun vadeli. Sperm canlılığı korumak için, şişeleri sıvı nitrojen içinde dalmış saklanır önemlidir. Deneyimlerimize göre, buhar fazında depolanan şişeleri zamanla canlılığını kaybeder.
    Hız önemlidir! Dölveriminin ekleyerek ve kuru buz sperm şişeleri yerleştirerek (yani adımları 6-10) arasında geçen süre en fazla 30 saniye olmalıdır.
    

Bölüm D: kriyoprezervasyon Sperm Kullanımı, Tüp Bebek Yöntemi

Biz bu iki kişi ile en iyi işe yaradığını bulabilirsiniz. Bir kişi, diğer kişinin sperm çözülür kadınlardan yumurta sıkar.

1. Bir su banyosunda 33 ° C'ye ayarlayın
2. Sıvı azot içeren Çözülme için hazır olana kadar Dewar balon, sıvı azot dondurucu ve transfer cryovial çıkarın.
3. 35mm plastik petri içine kadınlarda yumurta sıkın. Mümkünse, 3 debriyajlar yumurta elde etmek ve bir çanak birleştirmek için deneyin. İlk debriyaj 1 dakika içinde üç iyi kavramalar alamıyorsanız, o zaman (iyi bir kavrama yeterli olacaktır) 4. adıma geçin. Iyi kavrama tanımı:> 150 düzgün güzel görünümlü yumurta (yani sarımsı, beyaz döküntüler ile bozulması göstergesidir). Sperm çözülmüş ise kapalı çanak tutun.
4. Sıvı azot flakon çıkarın ve kapağı çıkarın. 33 ° C su banyosunda 8-10 sn hızla batırmayın flakon ~ 1 / 2 yolu.
5. Hızla yukarı ve aşağı pipetleme tarafından şişe ve karıştırmak için 70 ul oda sıcaklığında Hanks ekleyin. Hemen yumurta ekleyin ve pipet ucu ile hafifçe karıştırın.
6. Gecikmeden 750 ul balık su ekleyerek, sperm ve yumurta etkinleştirin. Çalkalanarak karıştırılır. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
7. 5 dakika sonra, 28 balık, su ve inkübe çanak çanak doldurmak ° C 2-3 saat sonra, sayım ve 100mm yemekleri (50/dish) bereketli embriyolar transfer. Infertil yumurta döllenme frekans tespit edilebilir, böylece güvenin.
8. Larvaların iyi dikkat edin! Ilk 5 gün için, günlük su değişimi ve ölü embriyolar kaldırmak. Sadece 5 gün kreş yüzmeye mesanesi larvaları koyun.

Bölüm E: Temsilcisi Sonuçlar

Biz 2001 ve 2003 yılları arasında toprağın işlenmesinde 8600 dondurulmuş sperm örneklerinin bir kütüphane yapmak için bu crypreservation metodoloji kullanılır. Bu örneklerin 106 çözülmüş ve doğurganlık tespit ettik. Doğurganlık canlı embriyoların in vitro fertilizasyon, dondurulmuş sperm ile döllenmiş yumurta toplam sayısına bölünmesiyle üretilen oranıdır. Taze (cryporeserved olmayan) sperm genellikle>% 95 bereket vardır; Kriyoprezerve sperm, çok daha düşük doğurganlık: bir ortalama% 29 (n = 106 şişeleri). Doğurganlık flakon-flakon değişkenliği,% 1'den daha az% 62 gibi yüksek değişen büyüktür. Bu değişkenlik, standart sapma Şekil temsil eden büyük bir hata çubukları tarafından temsil edilmektedir. 2. Ancak biz sadece bir kez, her iki sperm örnekleri 0% doğurganlık deneyimli ve ilgili toprağın işlenmesinde mutasyon kurtarmak için başarısız bugüne kadar çözülmüş 106 sperm örnekleri.

Birkaç yıl boyunca kütüphane sperm şişeleri çözülme (2001-2008) bu yöntemle dondurulmuş sperm örneklerinin ortalama doğurganlık kalmasını buldukistikrarlı bir zaman içinde (Şekil 2). 2001 yılında çözülmüş dondurulmuş sperm örneklerinin ortalama doğurganlık 23.5 (% 11 sperm örnekleri üzerinde) oldu ve 2008 yılında 25 (% 21 sperm örnekleri üzerinde) oldu.

Diğer araştırmacılar bir dizi şimdi kendi laboratuarlarında bu sperm dondurma protokolü kullanıyor. Bazı gözlediğimiz benzer doğurganlık oranları ve örnek-örnek değişkenliği ile iyi bir başarı bildirdin. Diğerleri bildirildiğine göre bu protokolü ellerinde çalışmasını sağlamak için başarısız oldu. Biz muhtemel sorunların kaynakları olduğuna inanıyoruz:

1. , Farklı bir kuru buz soğutma oranı yol açan, protokol önerilen tam cryovials veya konik tüpler kullanmak durumunda
2. Bir alt-optimal soğutma oranı, toz, kuru buz kullanmak durumunda
3. Kötü doğurganlık erkek balık tek bir erkek sperm ul en az 1 almalısınız. Ayrıca taze sperm ile in vitro fertilizasyon yaparak erkek doğurganlığı test edebilirsiniz,% 100 doğurganlık yakın almak için çok az taze sperm alır, çünkü ancak bu yanıltıcı olabilir.
4. In vitro fertilizasyon, alt-standart kalitede yumurta kullanılması. Bir şey ama mükemmel debriyajlar kullanılması her zaman,% 0 doğurganlık yakın, aslında iyi doğurganlık (yinelenen flakonun doğurganlık dayalı) olan sperm örnekleri bile yol açar.

Şekil 1 sperm dondurma yöntemi şematik.

Şekil 2 kriyoprezervasyon sperm doğurganlık zaman içinde sabit kalır. Yüzde doğurganlık, dondurulmuş sperm ile döllenmiş yumurta toplam sayısına bölünmesiyle in vitro fertilizasyon üretilen canlı embriyo sayısı. "N", doğurganlık ilgili yıl içinde test edildi Kriyoprezerve sperm şişeleri sayısını ifade eder. Hata çubukları standart sapma temsil eder. Her sperm flakon farklı bir erkek olduğu için, flakon-flakon değişkenlik görülmektedir.

Discussion

Diğer araştırmacılar bir dizi şimdi kendi laboratuarlarında bu sperm dondurma protokolü kullanıyor. Bazı benzer bereket ve gözlediğimiz aynı örnek örnek değişkenlik bildirdin. Diğerleri bildirildiğine göre bu protokolü ellerinde çalışmasını sağlamak için başarısız oldu. Biz muhtemel sorunların kaynakları olduğuna inanıyoruz:

1. , Farklı bir kuru buz soğutma oranı yol açan, protokol önerilen tam cryovials veya konik tüpler kullanmak durumunda
2. Bir alt-optimal soğutma oranı, toz, kuru buz kullanmak durumunda
3. Kötü doğurganlık erkek balık tek bir erkek sperm ul en az 1 almalısınız. Ayrıca taze sperm ile in vitro fertilizasyon yaparak erkek doğurganlığı test edebilirsiniz,% 100 doğurganlık yakın almak için çok az taze sperm alır, çünkü ancak bu yanıltıcı olabilir. Daha büyük, daha sağlam renkli erkekler genellikle daha yüksek kalitede sperm verir.
4. In vitro fertilizasyon, alt-standart kalitede yumurta kullanılması. Bir şey ama mükemmel debriyajlar kullanılması her zaman,% 0 doğurganlık yakın, aslında iyi doğurganlık (yinelenen flakonun doğurganlık dayalı) olan sperm örnekleri bile yol açar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μl disposable pipettes	Fisher Scientific	22-358697
Watch glasses	Pyrex	9985-75
2 ml cryogenic vials	Corning	430488
10 x 10 cryoboxes	Nalge Nunc international	03-337-7AA
15 ml conical tubes	Falcon BD	352099
Tongs	Fisher Scientific	10-316B
Cryofreezer	Taylor-Wharton	K-series	For example