Высокая пропускная метод для криоконсервации спермы и данио рерио In Vitro Оплодотворение

Summary

Это высокой пропускной способностью спермы криоконсервация протокол для рыбок данио. Сперма криоконсервированных использовании этого протокола в среднем на 25% рождаемости в последующие экстракорпорального оплодотворения и остается стабильной на протяжении многих лет.

Abstract

Это метод для криоконсервации спермы данио рерио, что является адаптацией метода Харви (Harvey и соавт., 1982). Мы ввели два изменения в первоначальный протокол, как упростить процедуру увеличения и однородность выборки. Во-первых, мы нормализовать все спермы тома с использованием замораживания средств массовой информации, не содержащей криопротекторов. Во-вторых, криоконсервированных спермы хранятся в криопробирки вместо капилляров. Темпы спермы замораживания и оттаивания (δ ° C / время), вероятно, два наиболее важных переменных для управления в этой процедуре. По этой причине, не заменяют различные трубы для указанных. Работа в группах из 2 можно заморозить сперму 100 мужчин за команду в ~ 2 часа. Сперма криоконсервированных использовании этого протокола в среднем на 25% рождаемости (измеряется как количество жизнеспособных эмбрионов генерируется в экстракорпорального оплодотворения, деленное на общее количество яиц, оплодотворенных) и этот процент рождаемости остается стабильной на протяжении многих лет.

Protocol

Часть: Сперма Решения Замораживание

1. Гинсберг Рыба Ringers (Make свежей каждые 3 дня; Гинзбург, 1963)

Примечание: порядок добавления важно не допустить ОСАДКОВ

В 450 мл стерильного ddH2O растворяться:

• NaCl 3,25 г
• KCl 0,125 г
• CaCl2 • 2 Н2О 0,175 г
  Затем добавить:
• NaHCO3 0,10 г

Принесите конечный объем до 500 мл стерильного ddH2O и хранить при температуре 4 ° C.

2. Замораживание Средняя (Сделать новый ежедневно)

1. Без метанола
   • Гинзбург Рыба Ringers 10 мл (комнатной температуры).
   • Сухое обезжиренное молоко 1,5 г
2. С метанолом
   
   Примечание: порядок добавления важно не допустить ОСАДКОВ
   
   
   • Гинзбург Рыба Ringers 9 мл (комнатной температуры).
   • Метанол 1 мл
   • Сухое обезжиренное молоко 1,5 г
   
   После сборки замораживания средств массовой информации, хорошо перемешать в течение 20 мин. на орбитальный шейкер или рокера. Перед использованием аликвоту в 1 мл пробирок Эппендорф, избегая поверхности пузырьков.
   

Часть B: Материалы, необходимые для замораживания спермы

Материалы, необходимые для замораживания спермы

1. 10 мкл одноразовые пипетки (Fisherbrand кошка # 22-358697)
2. 250 мл стаканы для рыбы вода, содержащая MESAB / Tricaine
3. часовые стекла (Pyrex кошка # 9985-75)
4. P20 pipetman (или эквивалент) и советы
5. Губка рыбы держатель (держать мужчин при сдавливании)
6. Пройдя через микроскоп с освещением выше стадии
7. Плоские щипцы (например, Millipore типа)
8. 2,0 мл криогенных флаконах (Corning кошка # 430488)
9. 10X10 cryoboxes (Nalgene кошка # 03-337-7AA)
10. Пенополистирола контейнер, заполненный ~ 15 см из мелко измельченных сухих ICE1
11. 15 мл конические пробирки (Falcon # 352099)
12. Сосуд Дьюара с жидким азотом
13. Длинные щипцы (например, CMS Фишер здравоохранения кошка # 10-316B)
14. Cryogloves
15. Бак для грязной воды для мужчин
16. Один Эппендорф трубки, заполненной замораживания средств массовой информации без метанола
17. Один Эппендорф трубки, заполненной замораживания средств массовой информации с метанолом
18. Cryofreezer (например, Тэйлор-Уортон K-серии)

¹ простой метод для изготовления мелко измельченного сухого льда обернуть его в полотенце и распылить его с молотка. Более эффективным методом является использование сухого льда мясорубку, например Клоусон модель RE-2.

Часть С: Метод замораживания спермы

1. MARK капилляров: До начала отмечать 10 мкл капиллярной трубки с лабораторией пера на уровне 3,33 мкл (т.е. 16,7 мм снизу, см. рис 1.1.).
2. Обезболить МУЖЧИНЫ: Место мужчины (ы) в стакан, содержащий MESAB / tricaine разводят в воде рыбы (рецепт в "данио рерио книга")
3. СУХОЙ FISH: Как только под наркозом, поднять рыбу из анестезии использованием пластиковой ложкой и осторожно пятно сухой рыбы на бумажное полотенце, обращая особое внимание на сушку брюшной стороне. Вода активизирует спермы, поэтому важно, чтобы тщательно высушите вокруг клоаки. Позиция рыбы на губки держателя, вентральной стороной вверх (рис. 1.2). Если область вокруг анального плавника еще влажные, мягко насухо kimwipe. Будьте осторожны, чтобы не сжать спермы преждевременно!
4. Место отмечено капиллярной трубке в резиновых рот пипеткой адаптер, который входит в капиллярах. Адаптер резиновый шланг, который мундштука на одном конце и капиллярные держатель на друга. Кроме того, капиллярная трубка может быть подключена к 50 мкл шприце Hamilton через короткий кусок Tygon трубок соответствующего диаметра.
5. Место мужчины в сферу и разоблачить мочеполовой открытия, тщательно распространения брюшные плавники, кроме использования конца капилляра.
6. COLLECT спермы: Выгнать спермы, осторожно поглаживая стороны рыбы с гладкими щипцы (например, Millipore), или, осторожно сжимая стороны рыбы между указательным и большим пальцем. Сбор спермы в капиллярной трубке, как это изгнаны использованием деликатного всасывания (рис. 1.2). Избегайте фекалии, которые могут быть высланы со спермой.
7. НОРМАЛИЗАЦИИ СПЕРМЫ VOLUME до 3,3 мкл: Если объем спермы достигает или превышает пером след в капиллярной трубке (т.е. 16,7 мм и более), то переходите к шагу 8. Если сперма объем не достигает целевого объема, то нормализовать объем ручка марки использованием замораживания среды без метанола (рис. 1.3). Минимальное количество спермы, которое является приемлемым варьируется в зависимости от качества спермы. Хорошая сперма белой и непрозрачной. Бедные сперма выглядит водянистым. В общем, мы принимаем как минимумы: 1 мкл хорошей спермы (или 1 / 3 цели) и 2 мкл бедные спермы (или 2 / 3 цели). Объем сейчас нормирована на 3,3 мкл.
8. ДОБАВИТЬ криопротектора для спермы: подлизываться Замораживание Средний С Мэтанола, оранжевый знак (ок. общего объема в настоящее время 20 мкл;. Рис 1.4). Выгнать спермы и криопротектора смесь на чистом районе часовым стеклом, уделяя особое внимание, чтобы не ввести пузыри. Аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз ~ 4 раза (не вводить пузырьков).
9. МЕСТО 10 мкл спермы в каждый из 2 криопробирки: Внесите 10 мкл спермы: криопротектора раствор в нижней части два отдельных криопробирки, которые были помечены соответствующей информации (рис. 1.5). Быстрые, крышка флакона и помещать их в нижней части комнатной температуре 15 мл Сокол труб одного криопробирку / трубы. Cap Сокол трубку и вставить пару криопробирку содержащих труб Сокол в измельченный сухой лед.
10. FREEZE спермы в течение 20 мин. На сухом льду: Сухой лед должны быть в прекрасной форме порошка, а не гранулы. Трубы должны быть вставлены в сухой лед достаточно глубоко, что только шапки показывают (рис. 1.6). Для того, чтобы отслеживать труб в сухой лед, дать каждой паре труб Сокол число от 1-20 (написано на колпачки) и записывать время они входят в сухой лед.
11. МЕСТО криопробирки в жидкий азот. После сперма была заморожена на сухом льду в течение 20 мин, перенесите их в жидкий азот-содержащие сосуд Дьюара. Сперма сохраняется здесь до времени поместить в морозильную камеру жидкий азот. При размещении в морозильнике ящики, место морозильник окно в ванну с жидким азотом, что образцы не нагреваются. Используйте длинные щипцы металла для восстановления флаконы из сосуда Дьюара и ручка с cryogloves. Кроме того, криопробирки могут быть переданы непосредственно от сухого льда в морозильной камере поле, если морозильник поле сохраняется, погруженной в жидкий азот в контейнер из пенопласта.
12. Магазин криопробирки долгосрочной перспективе в криогенном морозильнике жидкого азота. Для поддержания жизнеспособности сперматозоидов, важно, чтобы флаконы хранятся, погруженной в жидкий азот. По нашему опыту, флаконы хранятся в паровой фазе теряет жизнеспособность в течение долгого времени.
    Скорость важна! Время между добавлением криопротектора и размещение спермы флаконов в сухой лед (т.е. шаги 6-10) должно быть не более 30 сек.
    

Часть D: Экстракорпоральное оплодотворение метода с помощью Криоконсервированные спермы

Мы считаем, что это лучше всего работает с двумя людьми. Один человек сжимает яйца от самок в то время как другой человек тает спермы.

1. Установите водяной бане до 33 ° C.
2. Удалить криопробирку из жидкого азота морозильник и трансфер в жидкий азот-содержащие сосуд Дьюара до готовности к оттепели.
3. Сожмите яйца от самок в 35 пластиковых чашках Петри. Если возможно, постарайтесь получить 3 кладки яиц и объединить в одно блюдо. Если вы не можете получить три хороших муфт в течение 1 мин вашего первого сцепления, затем перейдите к шагу 4 (одно хорошее сцепление бывает достаточно). Определение хорошего сцепления:> 150 равномерно приятные глазу яйца (например, желтоватый, без белого мусора свидетельствует о деградации). Держите блюдо покрытый в то время как сперматозоиды не разморозится.
4. Удалите флакон с жидким азотом и снять крышку. Быстро погрузите флакон ~ 1 / 2 путь в 33 ° С водяной бане в течение 8-10 сек.
5. Быстро добавить 70 мкл комнатной температуре Хэнкс, чтобы флакон и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Сразу же добавить яйца и осторожно смешать с кончика пипетки.
6. Безотлагательно, активировать сперматозоиды и яйцеклетки, добавив 750 мкл воды рыбу. Swirl перемешать. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
7. Через 5 мин, заполните блюдо с водой рыбы и инкубировать блюдо при 28 ° C. Через 2-3 часов, подсчет и перенос эмбрионов плодородной до 100мм блюд (50/dish). Граф неоплодотворенные яйца, так что оплодотворение частота может быть определена.
8. Заботьтесь о личинок! За первые 5 дней, смена воды ежедневно и удалить мертвые эмбрионы. Положите только личинки, которые имеют плавательные пузыри в питомник на 5 день.

Часть E: Представитель Результаты

Мы использовали этот crypreservation методологию, чтобы сделать библиотеку 8600 замороженные образцы спермы для возделывания в период с 2001 по 2003 год. Мы талой 106 из этих образцов и определил их плодородия. Плодовитость соотношение жизнеспособных эмбрионов производится в экстракорпорального оплодотворения, деленное на общее количество яиц, которые были оплодотворены замороженной спермы. Свежие (не cryporeserved) сперма обычно имеет> 95% плодородия; криоконсервированных спермы намного ниже рождаемость: в среднем на 29% (п = 106 флаконов). Флакон до флакона изменчивости рождаемости велик, начиная от менее чем 1% до достигать 62%. Эта изменчивость представлена ​​большая ошибка бары представляют стандартное отклонение на рис. 2. Однако в 106 образцы спермы талой на сегодняшний день мы имеем только один раз опытные 0% рождаемости в обеих образцы спермы и не смогли восстановить соответствующие мутации вспашки.

По оттаивания спермы флаконы из нашей библиотеки в течение нескольких лет (2001-2008) мы обнаружили, что средняя плодовитость образцы спермы замороженных с помощью этого метода остаетсястабильным во времени (рис. 2). Средняя плодовитость замороженные образцы спермы талых в 2001 году составила 23,5% (исходя из 11 образцов спермы) и в 2008 году составил 25% (на основе 21 образцов спермы).

Ряд других исследователей в настоящее время используют этот протокол замораживания спермы в своих лабораториях. Некоторые из них сообщали о хороших успехов рождаемости и образца к образцу изменчивости похоже на то, что мы наблюдали. Другие, как сообщается, не в состоянии сделать этого протокола работы в их руках. Мы считаем, что вероятными источниками проблем являются:

1. Отказ от использования точной криопробирки или конических труб мы предложили в протоколе, что приводит к различной скорости охлаждения, когда в сухой лед;
2. Отказ от использования порошкового сухого льда, что приводит к неоптимальной скорости охлаждения;
3. Использование самец с плохой рождаемости: вы должны получить не менее 1 мкл спермы от одного мужчины. Вы также можете проверить мужскую фертильность, делая искусственное оплодотворение свежей спермы, однако это может ввести в заблуждение, потому что она занимает очень мало свежей спермы, чтобы получить около 100% плодородия.
4. Использование нестандартных яйца качества экстракорпоральное оплодотворение. Использование ничего, но совершенная муфты всегда приводит к около 0% рождаемости, даже с образцами спермы, которые фактически имеют хорошую рождаемости (на основе плодородия дублировать флакон).

Рисунок 1. Схема спермы методологии замораживания.

Рисунок 2. Криоконсервированные фертильность спермы остается стабильным с течением времени. Процент рождаемости количество жизнеспособных эмбрионов производится в экстракорпорального оплодотворения, деленное на общее количество яиц, которые были оплодотворены замороженной спермы. "П" относится к числу криоконсервированных флаконов спермы которых рождаемость была протестирована в соответствующем году. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение. Поскольку каждый сперматозоид флакон с различными мужчинами, флакон до флакона изменчивость наблюдается.

Discussion

Ряд других исследователей в настоящее время используют этот протокол замораживания спермы в своих лабораториях. Некоторые из них сообщали о подобных плодородия и того же образца к образцу изменчивости, которые мы наблюдали. Другие, как сообщается, не в состоянии сделать этого протокола работы в их руках. Мы считаем, что вероятными источниками проблем являются:

1. Отказ от использования точной криопробирки или конических труб мы предложили в протоколе, что приводит к различной скорости охлаждения, когда в сухой лед;
2. Отказ от использования порошкового сухого льда, что приводит к неоптимальной скорости охлаждения;
3. Использование самец с плохой рождаемости: вы должны получить не менее 1 мкл спермы от одного мужчины. Вы также можете проверить мужскую фертильность, делая искусственное оплодотворение свежей спермы, однако это может ввести в заблуждение, потому что она занимает очень мало свежей спермы, чтобы получить около 100% плодородия. Большие, более надежно цветные мужчины обычно дают более высокое качество спермы.
4. Использование нестандартных яйца качества экстракорпоральное оплодотворение. Использование ничего, но совершенная муфты всегда приводит к около 0% рождаемости, даже с образцами спермы, которые фактически имеют хорошую рождаемости (на основе плодородия дублировать флакон).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μl disposable pipettes	Fisher Scientific	22-358697
Watch glasses	Pyrex	9985-75
2 ml cryogenic vials	Corning	430488
10 x 10 cryoboxes	Nalge Nunc international	03-337-7AA
15 ml conical tubes	Falcon BD	352099
Tongs	Fisher Scientific	10-316B
Cryofreezer	Taylor-Wharton	K-series	For example