Summary
이것은 바로 자외선 - inactivated 정자와 수정 후 두 번째 meiotic 부서 차단하여 gynogenetic의 diploid의 zebrafish의 배아 (단 유전적 기여 어머니의 유래 배아)를 생성하는 방법입니다. EP의 배아는 첫 번째 meiotic 부문 중 재조합에 의해 완전히 homozygous하지 않습니다, 그러나 그들은 재조합하여 centromere에서 분리되지 않은 모든 loci에 homozygous 있습니다.
Abstract
diploid의 eukaryotes에 Heterozygosity 종종 유전자 연구 성가신합니다. heterozygous 여성에서 직접 가능한 homozygous diploid의 자손을 생산 방법은 F1 mutagenized 여성이 가속 앞으로 유전 화면에 해로운 돌연변이 직접 검사를 할 수 있습니다. Streisinger 외.
Protocol
초기 압력의 개요
참고 사항 : tricaine, 생선 물 행크스 호수로이 프로토콜에서 사용되는 시약의 많은 요리법 Zebrafish 도서 3 조 (의 10 장에서 사용할 수있는 온라인 http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html )
- UV inactivated 정자를 사용하여 체외의 수정에 의해 배아를 생성합니다.
- 즉시 계란 물을 브림에 가득찬 유리관 (플라스틱 스냅 캡 포함)로 수정된 달걀을 전송합니다. 라텍스 고무의 얇은 시트로 유리병의 열린 끝을 커버와 고무 위에 유리병에 상단에 (구멍이 절단되어있는로) 스냅인.
- 액압 프레스의 병을 놓고 1.4 분 배입니다 8,000 PSI (많은 프레스는 2 인치 직경 피스톤에 끼쳤다 압력을 읽을 보정되며, 그 결과가 PSI로 변환해야합니다)에 압력을 올리기
- 수정 후 6 분 시작, 점차적으로 1 분 동안에 걸쳐 압력을 릴리스합니다.
상세 초기 압력 절차
- 실험 전날
- 늦은 오후에는 별도의 남성과 여성은 압착 수 있습니다. 그는 유전 물질을 공헌하지 않습니다 때문에 모든 중년 남성이 사용할 수 있습니다. 암컷은 뱃속에서 크고 뚱뚱해 보인다는 것입니다. 수컷은 노란색과 스프 라이 보일 것입니다.
- 여성들이 쉽게 아침에 액세스할 수 있습니다 탱크를 들고 야간에 별도로 남성을 잡아.
- 실험의 아침
- 행크스 솔루션을 준비, 나트륨 중탄산염를 추가합니다.
- 생선 시설 지참 : 정자를 수집하기위한 얼음 양동이, 행크스, Tricaine, 타이머, 튜브.
- 생선 물 Tricaine를 희석
- 정자를 수집
- 얼음 행크스 솔루션의 명확한 유리병을 준비합니다. 측정 ~ 남성 50 μl가 압착 수 있습니다.
- tricaine에 집중하여 한 번에 3 또는 4 남자를 마취. 그들은 플라스틱 스푼으로 마취에서 해제하실 수 있습니다.
- 생선 물에 씻어 종이 타월 (매우 중요 : 물 활성화의 정자)에 "습기가 건조"를 얼룩.
- 에피 조명과 낮은 배율에서 stereomicroscope 아래 거품 홀더 물고기를 탑재합니다. 포셉와 골반 지느러미를 분리하여 하수의 개통에 microcapillary 위치를.
- 부드럽게 그러나 단호하게 부드러운 (Millipore) 포셉와 물고기의 스트로크 측면.
- 밀키 정자의 성기 구멍에서 나올으로 부드러운 흡입을 사용하여 microcapillary에 수집합니다.
- 얼음처럼 차가운 행크의 호수에서 여러 남성에서 풀 정자. 50-10 남성의 정자는 수백 계란의 수정에 적합합니다. 추운 행크스의의 정자는 몇 시간 또는 며칠 동안 효율적으로 달걀을 비옥 것입니다. 흐린 정학을 할 수있을 정도로 충분한 수집 "안구"정자의 농도.
- 자외선은 정자를 inactivate
- 얼음 유리 페트리 접시의 바닥을 채우십시오.
- 접시에 얼음 위에 watchglass 놔.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 watchglass에 시험관에서 정자를 전송합니다. 그것으로 공기의 거품을 차지하지 않고 가능한 피펫으로 정자만큼 받아보실 수 있습니다. 또한 거품이 피펫에서 추방 그대로 watchglass에있는 정자하지 않습니다. 시계 유리에 얇은 심지어 레이어에 정자를 추방. 이 피펫을 삭제.
- UV 크로스 링커에 페트리 접시를 놓습니다
- 이분에 대한 crosslinker 켭니다
- CLEAN 피펫을 사용하면, watchglass에서 정자를 제거하고 얼음 UV 정자와 장소를 표시 eppendorf 튜브에 전송할 수 있습니다.
- 에그 수집 및 체외은 수정
- tricaine에서 한 번에 서너 여성을 마취.
- 생선 물에 씻어 종이 타월에 "습기가 건조"를 얼룩. 초과 물이 알을 팽창하고 수정을 방지할 수 있습니다.
- 35mm 플라스틱 페트리 접시와 습기 (서부 유럽 표준시되지 않음) 손가락으로 여자를 놓고, 부드럽게하지만 단단히 배꼽 누르십시오. 그녀가 알을 낳기 위해 준비하는 경우, 그들은 아주 쉽게 나올 것입니다.
- 주걱으로 달걀을 모아서 물을 암컷을 반환합니다. (아래 참조) 여성하던 메뚜기 알이 너무 길고 흰 및 워터리 반면 좋은 계란은 노란, 반투명 색상입니다. 좋은 계란을 받고 보장하기 위해, 물고기 시설에서 오는 불빛 후 처음 2 시간 동안 그들을 수집합니다. 건조 아웃을 방지하기 위해 적용 달걀 보관하십시오.
- , 달걀에 자외선 정자 정지의 30-50 μl를 추가 피펫 팁로 부드럽게 저어.
- 즉시정 물고기 물 약 1 ML을 추가하고 타이머를 시작합니다. 이 시점에서 개발 왼쪽 달걀 haploids 것입니다.
- . 초기 압력 참고 : 단계 AG는 수정 후 90 초 내에 달성해야합니다!
- 계란은 물을 추가하여 활성화되는 순간에 타이머를 시작합니다
- 잠시 만요,하고 접시의 중앙에 더 많은 물, 소용돌이 계란을 추가합니다.
- 차단과 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 압력 튜브에 수정된 달걀을 전송합니다.
- 필요한 경우 그들은 거의 유리병의 입술에 물을 비드를 떠나, 넘쳐 수 있도록, 유리병에 더 많은 계란 물을 추가합니다.
- 물의 구슬을 통해 고무 위로 플레이스와 고무 위에 플라스틱 뚜껑을 확보.
- 리필 실린더에 더 많은 달걀 물을 추가 거꾸로 압력 실린더의 병을 (들)을 놓으십시오. 안전 실린더 위에 올려.
- 플런저와 언론의 실린더를 놓고 8,000파운드 / 평방를 적용합니다. 인치
- 인증의 시간 후 6 분 (압력 4.5 분 총 시간)까지 언론에 실린더를 남겨주세요.
- 활성화 후 6 분, 언론에서 실린더를 제거하고, 실린더의 튜브를 제거합니다. 조심스럽게 배아의 냉각을 방지하기 위해 튜브를 건조.
- 실린더 및 리필 그 달걀 물로를 재설정하십시오.
- 필요에 따라 부분적으로 계란 물을 그들을 작성하여 다음 튜브를 준비합니다.
- 계란의 모든 일괄 처리에 대해 반복합니다.
참고 : 실린더는 한 번에 세 튜브까지 개최되므로 이미 tricaine의 다른 암컷이 알을 주면 몇 분보고 알을 수정을 지연 할 수 있습니다. 이것은 한 번에 더 많은 일괄 처리하여 속도 것들을 도움이 될 것입니다. 또한, 한번 언론이 치료가 완료될 때까지 tricaine에서 더 많은 물고기를 넣어하지 사용되고 기억 해요. 마취를 유지하기 위해 물고기가 너무 오래 그들을 죽일 수 있도록합니다. 둘째, 당신이 언론이 사용되는 동안 물고기를 그만두라하고, 계란을하면, 그들은 언론을 다시 사용할 수있는 시간에 가능한 너무 건조 수 있습니다.
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Discussion
이 방법에 의해 만들어진 배아 사실 gynogenetic의 diploids되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 컨트롤로 정상 diploid 달걀 (UV - 불활 성화없이 정자의 일부를 별도로 유지하여)와 haploid 배아 (EP 절차를 거치지 않고 UV 정자와 함께 수정된 계란의 클러치를 별도로 유지하여)의 클러치의 클러치를 생성합니다. 일일 게시물 수정의 haploid의 배아에서 짧은 몸 축, 불규칙한 두뇌와 체절의 형태 있습니다. Haploids 2-3 일 후에 가능한되지 않습니다. 어떤 불규칙 "EP 괴물"이 발생할 수 있지만, EP의 diploids은 정상 diploids 같이한다. EP의 diploids의 클러치는 (70~90%) 대부분 가능한되어야합니다. EP의 diploid 클러치에 haploids의 존재는 EP 과정에서 (예를 들어, 압력을 가질 실패 언론) 실패를 제안합니다. haploid 클러치 diploids의 존재는 불완전 정자 불활 성화 (예 : crosslinker에 실패) 제안합니다.
EP의 diploids는 앞으로 유전자 화면 4,6에서 확인지도 돌연변이로 유전자 centromere 거리 하나를 결정하는 데 사용되었습니다. 앞으로 EP의 diploid의 배아의 초기 화면은 나중에 발달 과정 모두에 관여 유전자를 식별하는 효율적인 방법이며, 오늘날 5,7 사용되고 있습니다.
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Acknowledgments
체외의 수정 및 gynogenetic의 diploids에 대한 방법은 1970 년대와 1980 년대 오레곤 대학의 조지 Streisinger의 실험실에 챠라인 워커에 의해 zebrafish를 위해 개발되었습니다. 방법은 여기에 설명된 것은 Zebrafish 도서 3 전체에서 사용할 수 있습니다 챠라인의 프로토콜에서 변하지입니다.
체외의 수정 및 gynogenetic의 diploids에 대한 방법은 1970 년대와 1980 년대 오레곤 대학의 조지 Streisinger의 실험실에 챠라인 워커에 의해 zebrafish를 위해 개발되었습니다. 방법은 여기에 설명된 것은 Zebrafish 도서 3 전체에서 사용할 수 있습니다 챠라인의 프로토콜에서 변하지입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | ||
| Watch glass | |||
| French Press | |||
| Pressure cylinder | |||
| Instant ocean | |||
| Pasteur pipettes | Cut off the narrow end, fire polish | ||
| UV cross-linker | |||
| microcapillaries |
References
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
