Summary
यह पराबैंगनी प्रकाश निष्क्रिय शुक्राणु के साथ निषेचन के तुरंत बाद दूसरे meiotic विभाजन अवरुद्ध करके gynogenetic द्विगुणित zebrafish भ्रूण (भ्रूण जिसका केवल आनुवंशिक योगदान माँ से आता है) पैदा करने के लिए एक विधि है. EP भ्रूण पूरी तरह से homozygous पुनर्संयोजन के कारण पहली meiotic विभाजन के दौरान नहीं कर रहे हैं, लेकिन वे सभी loci कि उनके centromere से पुनर्संयोजन द्वारा अलग नहीं किया गया है homozygous हैं.
Abstract
द्विगुणित eukaryotes में Heterozygosity अक्सर आनुवंशिक अध्ययन बोझिल बना देता है. तरीकों कि विषमयुग्मजी महिलाओं से व्यवहार्य homozygous द्विगुणित वंश सीधे उत्पादन F1 mutagenized महिलाओं के लिए हानिकारक परिवर्तन के लिए सीधे आगे एक त्वरित आनुवंशिक स्क्रीन में जांच की अनुमति देते हैं. Streisinger एट अल.
Protocol
जल्दी दबाव के अवलोकन
नोट: अभिकर्मकों tricaine, मछली पानी और हैंक्स खारा के रूप में इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता के कई के लिए व्यंजनों Zebrafish बुक 3 (10 अध्याय में ऑनलाइन उपलब्ध हैं http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html )
- इन विट्रो निषेचन में यूवी निष्क्रिय शुक्राणु का उपयोग भ्रूण का निर्माण.
- तुरंत एक गिलास शीशी (एक प्लास्टिक की तस्वीर टोपी के साथ) अंडे पानी के साथ सीमा से भरा निषेचित अंडे हस्तांतरण. लेटेक्स रबर की एक पतली शीट के साथ कवर शीशी के खुले अंत और रबर अधिक शीशी पर शीर्ष तस्वीर (जिसमें एक छेद में कटौती कर दी गई है).
- एक हाइड्रोलिक प्रेस में शीशी प्लेस और 1.4 मिनट में निषेचन के बाद ८,००० साई (ध्यान दें कि कई प्रेस 2 इंच की एक व्यास पिस्टन पर दबाव पढ़ने कैलिब्रेटेड हैं, और रीडिंग साई के लिए परिवर्तित किया जाना चाहिए) के लिए दबाव बढ़ा
- निषेचन के बाद 6 मिनट पर शुरू, धीरे धीरे 1 मिनट की अवधि पर दबाव जारी है.
विस्तृत जल्दी दबाव प्रक्रिया
- प्रयोग से पहले दिवस
- देर से दोपहर में, अलग पुरुषों और महिलाओं निचोड़ा हो. किसी भी पुराने नर के बाद से वह आनुवंशिक सामग्री योगदान नहीं होगा इस्तेमाल किया जा सकता है. मादा बड़े और वसा पेट में दिखना चाहिए. नर पीले और फुर्तीला दिखना चाहिए.
- महिलाओं और टैंक है, जहां वे आसानी से सुबह में पहुँचा जा सकता है है पकड़ में अलग रातोंरात पुरुषों पकड़ो.
- प्रयोग की सुबह
- हैंक्स समाधान तैयार, सोडियम बिकारबोनिट जोड़ने.
- मछली की सुविधा के लिए ले आओ: बर्फ बाल्टी, हैंक्स, Tricaine, टाइमर शुक्राणु इकट्ठा करने के लिए ट्यूबों.
- मछली पानी में Tricaine पतला
- शुक्राणु लीजिए
- बर्फ पर हैंक्स समाधान के एक स्पष्ट शीशी तैयार. ~ उपाय पुरुष प्रति 50 μl निचोड़ा हुआ हो सकता है.
- Tricaine में विसर्जन के द्वारा एक बार में 3 या 4 पुरुषों anesthetize. वे संवेदनाहारी के बाहर हो सकता है एक प्लास्टिक के चम्मच के साथ उठाया.
- मछली पानी में कुल्ला और एक कागज तौलिया (बहुत महत्वपूर्ण: पानी सक्रिय शुक्राणु) पर नम सूखी "दाग.
- महामारी रोशनी के साथ कम बढ़ाई stereomicroscope के तहत एक फोम धारक में मछली माउंट. संदंश के साथ पैल्विक पंख अलग और क्लोअका के उद्घाटन पर एक microcapillary स्थिति.
- मछली के स्ट्रोक पक्षों के धीरे लेकिन चिकनी संदंश (Millipore) के साथ मजबूती से.
- दूधिया शुक्राणु के रूप में जननांग ताकना से बाहर आते हैं, यह microcapillary में कोमल चूषण का उपयोग इकट्ठा.
- बहुत ठंडा है हांक खारा में कई पुरुषों से शुक्राणु पूल. 5-10 नर से शुक्राणु कई सौ अंडे के निषेचन के लिए पर्याप्त है. ठंड हैंक्स में शुक्राणु अंडे कई घंटे या दिन के लिए कुशलतापूर्वक खाद जारी रहेगा. "नेत्रगोलक" शुक्राणु की एकाग्रता, पर्याप्त इकट्ठा करने के लिए एक बादल निलंबन बनाने.
- यूवी शुक्राणु निष्क्रिय
- बर्फ के साथ एक गिलास पेट्री डिश के नीचे भरें.
- बर्फ की चोटी पर पकवान में एक watchglass रखो.
- एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, टेस्ट ट्यूब से watchglass पर शुक्राणु हस्तांतरण. इसके साथ हवा के किसी भी बुलबुले लेने के बिना संभव के रूप में पिपेट में जितना शुक्राणु की यकीन है. इसके अलावा, के रूप में आप उन्हें विंदुक से expelling हैं watchglass में शुक्राणु बुलबुला नहीं. एक पतली, घड़ी का शीशा पर भी परत में शुक्राणु निष्कासित. इस विंदुक त्यागें.
- एक यूवी पार linker में पेट्री डिश प्लेस
- 2 मिनट के लिए crosslinker पर मुड़ें
- एक स्वच्छ विंदुक का प्रयोग, watchglass से शुक्राणु को हटाने और यह एक Eppendorf ट्यूब यूवी और बर्फ पर शुक्राणु जगह चिह्नित करने के लिए स्थानांतरण.
- अंडे संग्रह और इन विट्रो में निषेचन
- Tricaine में एक समय में तीन या चार महिलाओं anesthetize.
- मछली पानी में कुल्ला और एक कागज तौलिया पर नम सूखी "दाग. अतिरिक्त पानी अंडे फूल और निषेचन को रोकने जाएगा.
- एक 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में और () गीला नहीं नम उंगलियों के साथ महिला प्लेस, धीरे लेकिन दृढ़ता से पेट पर दबाएँ. अगर वह अण्डे के लिए तैयार है, वे बहुत आसानी से आ जाएगा.
- एक रंग के साथ अंडे इकट्ठा और पानी के लिए महिला वापसी. अच्छा अंडे एक पीले, पारदर्शी रंग हैं, जबकि अंडे कि महिला में बनी हुई है बहुत लंबा सफेद और पानी रहे हैं (नीचे देखें). अच्छा अंडे हो रही है सुनिश्चित करने के लिए, उन्हें मछली सुविधा में पर आ रोशनी के बाद पहले 2 घंटे के दौरान इकट्ठा. बाहर सुखाने को रोकने के कवर अंडे रखें.
- अंडे के लिए यूवी शुक्राणु निलंबन की 30-50 μl जोड़ें, पिपेट टिप के साथ धीरे हलचल.
- तुरंतly मछली पानी के बारे में 1 मिलीलीटर जोड़ने और टाइमर शुरू . इस बिंदु पर विकसित करने के लिए छोड़ दिया अंडे haploids जाएगा.
- . अर्ली दबाव नोट: कदम एजी निषेचन के 90 सेकंड के भीतर पूरा किया जाना चाहिए!
- पल में टाइमर प्रारंभ कि अंडे पानी के अलावा द्वारा सक्रिय कर रहे हैं
- कुछ ही क्षणों की प्रतीक्षा करें और डिश के केंद्र के लिए अधिक पानी, भंवर अंडे जोड़ें.
- एक कट ऑफ और पॉलिश पाश्चर विंदुक का प्रयोग, दबाव शीशियों को निषेचित अंडे हस्तांतरण.
- यदि आवश्यक हो, शीशियों के लिए अधिक अंडे पानी जोड़ सकते हैं ताकि वे लगभग बह निकला रहे हैं, पानी की शीशियों के होंठ पर एक मनका छोड़ने.
- पानी की मनका पर एक रबर शीर्ष प्लेस और रबर पर प्लास्टिक के ढक्कन सुरक्षित.
- शीशी (एस) उल्टा दबाव सिलेंडर में नीचे रखें, सिलेंडर फिर से भरना करने के लिए और अधिक अंडे पानी जोड़ने. सिलेंडर के शीर्ष पर सुरक्षित रखो.
- सवार के साथ प्रेस में सिलेंडर प्लेस और 8000 एलबीएस / वर्ग को लागू. अंदर
- प्रेस में सक्रियण के समय के बाद 6 मिनट दबाव के 4.5 मिनट की कुल समय के लिए () जब तक सिलेंडर छोड़ो.
- सक्रियकरण के बाद 6 मिनट पर, प्रेस से सिलेंडर निकालने के लिए, और सिलेंडर से शीशियों को हटाने. ध्यान शीशियों सूखी भ्रूण के शीतलन को रोकने.
- रीसेट सिलेंडर और यह अंडे पानी के साथ फिर से भरना.
- आंशिक रूप से अंडे पानी के साथ उन्हें भरने के रूप में की जरूरत अगले शीशियों तैयार करें.
- अंडे के सभी बैचों के लिए दोहराएँ.
नोट: सिलेंडर एक समय में तीन शीशियों के लिए ऊपर पकड़ है, तो आप कुछ ही मिनटों अगर tricaine में पहले से ही अन्य महिलाओं के अंडे देने को देखने के लिए अंडे के निषेचन में देरी करना चाहते हो सकता है. यह गति चीजें एक समय में अधिक बैचों इलाज से मदद मिलेगी. यह भी याद है, एक बार प्रेस रखा जब तक इलाज पूरा नहीं tricaine में किसी भी अधिक मछली इस्तेमाल किया जा रहा है. मछली संवेदनाहारी में रहने के लिए भी लंबे समय उन्हें मार सकते हैं अनुमति दे. दूसरे, अगर आप मछली निचोड़ जबकि प्रेस इस्तेमाल किया जा रहा है, और अंडे प्राप्त करने के लिए, वे भी प्रेस फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है समय से व्यवहार्य हो सूखी हो सकता है.
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Discussion
यह महत्वपूर्ण है को यकीन है कि इस विधि द्वारा निर्मित भ्रूण सच gynogenetic diploids हैं. नियंत्रण के रूप में, सामान्य द्विगुणित (शुक्राणु की तरफ यूवी निष्क्रियता के बिना कुछ रखने के द्वारा) अंडे और अगुणित भ्रूण (EP प्रक्रिया के माध्यम से जा रहा बिना अलग यूवी शुक्राणु से निषेचित अंडे की एक क्लच रखकर) के एक क्लच के एक क्लच उत्पन्न करते हैं. 1 दिन के बाद निषेचन अगुणित भ्रूण से कम एक छोटी शरीर अक्ष, अनियमित मस्तिष्क और somite आकारिकी है. 2-3 दिनों के बाद Haploids व्यवहार्य नहीं कर रहे हैं. EP diploids सामान्य diploids की तरह लग रहे, हालांकि कुछ अनियमित "EP राक्षस होने पर हो सकती है चाहिए. EP diploids के चंगुल बड़े पैमाने पर हो (70-90%) व्यवहार्य चाहिए. EP द्विगुणित क्लच में haploids की उपस्थिति एक विफलता EP प्रक्रिया में (उदाहरण के लिए, दबाव पकड़ में नाकाम रहने के प्रेस) से पता चलता है. अगुणित क्लच में diploids की उपस्थिति अधूरा शुक्राणु निष्क्रियता (उदाहरण के लिए crosslinker में एक विफलता) से पता चलता है.
EP diploids नक्शा आगे आनुवंशिक 4,6 स्क्रीन में पहचान म्यूटेंट जीन centromere एक दूरी का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. अग्रेषित EP द्विगुणित भ्रूण की स्क्रीन के लिए दोनों जल्दी और बाद में विकास की प्रक्रिया में शामिल जीनों की पहचान एक कुशल तरीका है और 5,7 आज प्रयोग किया जा रहा है.
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Acknowledgments
Charline जॉर्ज Streisinger प्रयोगशाला में वाकर द्वारा 1970 और 1980 के दशक में ओरेगन विश्वविद्यालय में zebrafish के लिए इन विट्रो निषेचन और gynogenetic diploids में लिए तरीके विकसित किए गए. विधि यहाँ वर्णित Charline प्रोटोकॉल जो Zebrafish 3 बुक में पूर्ण में उपलब्ध हैं से अपरिवर्तित है.
Charline जॉर्ज Streisinger प्रयोगशाला में वाकर द्वारा 1970 और 1980 के दशक में ओरेगन विश्वविद्यालय में zebrafish के लिए इन विट्रो निषेचन और gynogenetic diploids में लिए तरीके विकसित किए गए. विधि यहाँ वर्णित Charline प्रोटोकॉल जो Zebrafish 3 बुक में पूर्ण में उपलब्ध हैं से अपरिवर्तित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | ||
| Watch glass | |||
| French Press | |||
| Pressure cylinder | |||
| Instant ocean | |||
| Pasteur pipettes | Cut off the narrow end, fire polish | ||
| UV cross-linker | |||
| microcapillaries |
References
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
