初期の圧力による雌性発生二倍体のゼブラフィッシュを作成

Summary

これは、すぐに紫外線で不活化精子と受精した後、第二減数分裂をブロックすることにより、雌性発生二倍体のゼブラフィッシュの胚（遺伝のみ寄与母親由来胚）を生成するための方法です。 EPの胚は、最初の減数分裂時の組換えが原因で完全にホモ接合体ではない、しかし、彼らは再結合することにより、動原体から分離されていないすべての遺伝子座でホモ接合である。

Abstract

二倍体真核生物におけるヘテロ接合性は、しばしば遺伝学的研究が面倒になります。ヘテロ接合の雌から直接実行可能なホモ接合二倍体の子孫を生成するメソッドは、F1変異女性が加速フォワード遺伝学的スクリーニングに有害な突然変異を直接スクリーニングすることができます。 Streisingerら。

Protocol

初期の圧力の概要

注：このようなtricaine、魚の水とハンクス生理食塩水、このプロトコルで使用される試薬の多くのためのレシピは、ゼブラフィッシュブック^3（第10章をオンラインで利用することができますhttp://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html ）

1. UV不活化精子を用いた体外受精で胚を作り出​​す。
2. すぐに卵を水でいっぱいに充填されたガラスバイアル（プラスチック製のスナップキャップ付き）に受精卵を転送する。ラテックスゴムの薄いシートでバイアルの開口端部を覆い、ゴム製オーバーバイアルにトップを（穴が切断されているに）スナップ。
3. 油圧プレスでバイアルを置き、1.4分で受精した後、8000 psiの（多くのプレス機を2インチ径のピストンにかかる圧力を読み取るために較正されている、との読みがPSIに変換する必要があることに注意）に圧力を上げる
4. 受精後6分で始まる、徐々に1分間の期間にわたって圧力を解放。

詳細な初期圧力の手順

1. 実験の前日
   1. 午後遅くに、別々の男性と女性が圧迫される。彼は遺伝物質を寄与されることはありませんので、どんな歳の男性を使用することができます。雌は腹に大きなや脂肪になるはずです。男性は黄色と元気なはずです。
   2. それらは容易に午前中にアクセスすることができるタンクを保持するには別に一晩女性と男性を保持する。
2. 実験の朝
   1. ハンクス溶液を調製、炭酸水素ナトリウムを加える。
   2. 魚の施設へ移動：アイスバケット、ハンクス、Tricaine、タイマー、精子を収集するためのチューブ。
   3. 魚の水にTricaineを薄める
3. 精子を集める
   1. 氷上ハンクス液の明確なバイアルを準備。測定〜男性当り50μlを圧迫する。
   2. tricaineに浸漬して、一度に3または4人の男性を麻酔。これらは、プラスチックスプーンで麻酔から持ち上げることができます。
   3. 魚の水ですすぎ、ペーパータオル（非常に重要：水を活性化精子）に"湿気、乾燥を"汚点。
   4. 落射照明と低倍率での実体顕微鏡下で泡のホルダーで魚をマウントします。鉗子と骨盤フィンを分離し、排出腔の開口部にマイクロキャピラリーを置きます。
   5. スムース（ミリポア）ピンセットで慎重に、しっかりと魚のストローク側面。
   6. 乳白色の精子が生殖孔から出てくるように、穏やかな吸引を用いてマイクロキャピラリーでそれを収集する。
   7. 氷冷ハンクス生理食塩水でいくつかの男性からのプールが精子。 50から10人の男性から精子の数百の卵の受精に適しています。寒いハンクスので精子は数時間あるいは数日のために効率的に卵を受精していきます。 "眼球"精子の濃度、濁った懸濁液を作るのに十分な収集。
4. UV不活性化精子
   1. 氷とガラスペトリ皿の底を埋める。
   2. 皿に氷の上にwatchglassを置く。
   3. パスツールピペットを使用して、watchglassに試験管から精子を転送する。それと空気の気泡を取ることなく、できるだけピペットに精子をできるだけ多く使うようにしてください。あなたがピペットからそれらを追放しているとしても、watchglassでバブル精子をしないでください。時計皿上に薄くで精子を排出する。このピペットを捨てます。
   4. UVクロスリンカーにペトリ皿を置き、
   5. 2分間架橋剤をオンにする
   6. 清浄なピペットを使用して、watchglassから精子を取り出して、氷上でUV精子と場所マークのエッペンドルフチュー​​ブに移す。
5. 採卵と体外受精
   1. tricaineで一度に3つまたは​​4つの女性を麻酔。
   2. 魚の水ですすぎ、ペーパータオル上で"生乾きにしたの"汚点。余分な水は卵を膨張し、受精を防ぐことができます。
   3. 35mmプラスチックシャーレに湿った（ウェットではない）指で女性を置き、腹に慎重にしっかりと押してください。彼女が産卵のために用意されている場合、彼らは非常に簡単に出てくるでしょう。
   4. へらで卵を収集し、水にメスを返します。 （下記参照）女性に残っている卵は長すぎる白と水っぽくなるのに対し、良い卵は、黄色がかった、透明感のある色です。良い卵を得る保証するために、魚の施設内に来てライトの後の最初の2時間の間にそれらを収集する。乾燥アウトを防ぐために覆われて卵を保管してください。
   5. 卵にUV精子懸濁液の30〜50μl加えて、ピペットの先端で軽くかき混ぜる。
   6. 即時LYは、魚の水の約1 mlを追加し、タイマーを起動します 。この時点で開発するために左の卵は半数体となります。
6. 初期の圧力注：。AGは、受精後90秒以内に達成しなければならないステップ！
   1. 卵は水の添加によって活性化された時点でタイマーを起動します。
   2. しばらく待ってから、皿の中央に、より多くの水、スワール卵を追加。
   3. カットオフと洗練されたパスツールピペットを用いて、圧力のバイアルに受精卵を転送する。
   4. 必要に応じて彼らはほとんどバイアルのリップで水のビーズを残して、あふれているように、バイアルに多くの卵の水を加える。
   5. 水のビーズ上のゴムの上に置き、ゴム上のプラスチック製の蓋を固定します。
   6. 補充シリンダーをするより多くの卵の水を加え、加圧シリンダーで上下逆さまにバイアル（s）を置きます。しっかりとシリンダーの上部を置く。
   7. プランジ​​ャーとプレスで円筒を置き、8000ポンド/平方を適用します。インチ
   8. 活性化の時間後の6分間（圧力の4.5分の合計時間）まで、プレスで円筒にしておきます。
   9. 活性化後6分で、記者からシリンダーを削除し、シリンダーからバイアルを取り外してください。慎重に胚の冷却を防ぐためにバイアルを乾燥させる。
   10. シリンダーと補充卵を水でリセット。
   11. 必要に応じて部分的に卵を水で埋めることによって、次のバイアルを準備。
   12. 卵のすべてのバッチについて繰り返します。

注：シリンダが一度に3バイアルまで保持されるので、すでにtricaineで他の雌は卵を与えるかどうかを確認するために数分を卵の受精を遅らせることをお勧めします。これは、一度に複数のバッチを処理することにより、最高速度のものを助ける。プレスが使用されている回も、治療が完了するまでtricaine内の任意のより多くの魚を入れていない覚えている。魚が長すぎる麻酔に滞在できるようにすることは、それらを殺すことができる。第二に、あなたがプレスが使用されている間に魚を絞る、と卵を得れば、彼らはマスコミを再び使用することができる時間で実行可能なように乾燥しすぎかもしれません。

Discussion

この方法により製造された胚は、真の雌性発生二倍体であることを確認することが重要です。コントロールとして、通常の二倍体の卵（UV不活化せずに精子のいくつかを取っておくことにより）と一倍体の胚（EPの手順を経由せずにUV精子で受精卵のクラッチを脇に保つことによって）のクラッチのクラッチを生成する。 1日の後の受精の一倍体胚ではショートボディの軸、不規則な脳と体節の形態を持っている。半数は2〜3日後に実行可能ではありません。いくつかの不規則な"EPのモンスターが"発生する可能性があるものの、EPの二倍体は、通常の二倍体のようになります。 EPの二倍体のクラッチは、（70〜90％）、主に実行可能でなければなりません。 EPの二倍体のクラッチの半数体の存在は、EPのプロセス（例えば、圧力を保持するために失敗を押して）で障害が発生したことを示唆している。半数体クラッチの二倍体の存在は、不完全な精子の不活性化を（例えば架橋剤の失敗）を示唆している。

EPの二倍体が前方に遺伝画面^4,6で識別されるマップの突然変異体に遺伝子セントロメア距離^1を決定するために使用されています。前方にEPの二倍体胚の画面は、初期とそれ以降の発達の両方のプロセスに関与する遺伝子を同定するための効率的な方法ですと、今日^5,7使用されている。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine	Sigma-Aldrich
Watch glass
French Press
Pressure cylinder
Instant ocean
Pasteur pipettes			Cut off the narrow end, fire polish
UV cross-linker
microcapillaries