Erken Basınç Gynogenetic Diployid Zebra balığı

Summary

Bu ultraviyole ışık inaktive sperm döllenme hemen sonra ikinci mayoz bölünme bloke ederek gynogenetic diploid zebrafish embriyolar (sadece genetik katkı anneden gelen embriyolar) üretmek için kullanılan bir yöntemdir. EP embriyolarının ilk mayoz bölünme sırasında rekombinasyon nedeniyle tamamen homozigot değildir, ancak onlar kendi sentromer ayrılmış rekombinasyon henüz tüm lokuslar homozigot.

Abstract

Diploid ökaryotlarda Heterozigosite genellikle genetik çalışmalar hantal yapar. Heterozigot kadınlarda doğrudan uygulanabilir homozigot diploid yavrular meydana Yöntemleri F1 mutagenized kadınlarda ileri genetik hızlandırılmış bir ekran doğrudan zararlı mutasyonlar için taranmalıdır izin verir. Streisinger et al.

Protocol

Erken basınç Genel Bakış

Not: tricaine, balık suyu ve Hanks, tuzlu su gibi, bu protokolde kullanılan reaktiflerin çoğu için yemek tarifleri Zebra balığı ^{Kitap 3} (bölüm 10 online http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html )

1. UV inaktive sperm kullanılarak in vitro fertilizasyon embriyolar üretin.
2. Hemen yumurta su ile ağzına kadar dolu bir cam flakon (plastik bir ek bileşenini kap ile birlikte) döllenmiş yumurta transferi. Lateks kauçuk ince bir levha ile flakonun açık ucuna kapak ve lastik üzerinde flakon üzerine üst (bir delik içine) ek bileşeni.
3. Hidrolik pres flakon yerleştirin ve gübreleme sonra 1.4 dakika, 8.000 psi (2-inç çaplı piston üzerine uyguladığı basınç okumak için birçok presler kalibre ve okumaları psi dönüştürülmesi gerekir) basıncını yükseltmek
4. 6 dk sonra döllenme başlayarak, yavaş yavaş 1 dakika bir süre içinde basınç bırakın.

Detaylı erken basınç prosedürü

1. Deney Önceki Gün
   1. Öğleden sonra, ayrı erkek ve kadın sıkılmış. Herhangi bir yaşında bir erkek, o genetik materyal katkıda olamayacağından kullanılabilir. Dişiler karnında büyük ve yağ bakmak gerekir. Erkekler sarı ve spry bakmak gerekir.
   2. Kadın ve sabah kolayca ulaşılabilir tankları tutarak gecede erkek ayrı ayrı tutun.
2. Deney Morning
   1. Hanks çözüm hazırlayın; sodyum bikarbonat ekleyin.
   2. Balık tesisi getirin: buz kovası, sperm toplamak için, Hanks, Tricaine, zamanlayıcı, tüpler.
   3. Balık su Tricaine sulandırınız
3. Sperm toplayın
   1. Buz üzerinde Hanks çözümün açık bir flakon hazırlayın. Ölçü ~ erkek başına 50 ul sıkılmış.
   2. Tricaine batırılma bir anda 3 veya 4 erkek anestezisi. Plastik bir kaşık ile anestezik kaldırılabilir.
   3. Balık suda yıkayın ve kağıt havlu (çok önemli: su aktive sperm) "ıslak-kuru" kurulayın.
   4. Epi-aydınlatma ile düşük büyütmede stereomikroskop altında köpük sahibinin balık monte edin. Forseps ile pelvik yüzgeçler ayrı ve lağım açılışında bir microcapillary pozisyon.
   5. Yavaşça ama iyice pürüzsüz (Millipore) forseps ile balık inme taraf.
   6. Sütlü sperm genital gözenek çıkıp, nazik vakum kullanarak microcapillary toplamak.
   7. Buz Hank salin birkaç erkek Havuzu sperm. 5-10 erkeklerde sperm döllenme için birkaç yüz yumurta yeterli. Soğuk Hanks Sperm birkaç saat veya hatta günler için verimli yumurtaları döllemek için devam edecektir. Bulutlu bir süspansiyon yapmak için yeterli toplama "Eyeball" sperm konsantrasyonu,.
4. UV sperm inaktive
   1. Bir cam petri kabı altındaki buz ile doldurun.
   2. Buz üstünde bir Dürbün çanak koyun.
   3. Pasteur pipeti kullanarak, test tüpünde sperm Dürbün üzerine aktarın. Hava kabarcıkları almadan pipet içine mümkün olduğu kadar sperm elde etmek için emin olun. Ayrıca, kabarcık pipet dışına çıkarılması gibi Dürbün sperm yoktur. Saat camı üzerinde ince bir tabaka sperm boşaltınız. BU pipet ATIN.
   4. UV çapraz bağlayıcı Petri kabı içine yerleştirin
   5. 2 dakika boyunca çapraz bağlayıcı açın
   6. TEMİZ pipet kullanarak, Dürbün sperm kaldırmak ve Eppendorf tüp, buz üzerinde UV Sperm ve yer işaretlenmiş bir transfer.
5. Yumurta toplama ve in vitro fertilizasyon
   1. Tricaine bir anda üç ya da dört kadın anestezisi.
   2. Balık suda yıkayın ve kağıt havlu "ıslak-kuru" kurulayın. Fazla su, yumurta şişmeye ve gübreleme önleyecektir.
   3. 35 mm plastik petri ve nemli (ıslak değil) parmakları ile dişi koyun, yavaşça ama göbek sıkıca basın. O yumurtalarını bırakmak için hazırlanmış ise, bu oldukça kolay çıkacaktır.
   4. Bir spatula ile yumurta toplayın ve su kadın dönmek. İyi yumurta, (aşağıya bakın) dişi kalmış yumurta çok uzun, beyaz ve sulu ise sarımsı, yarı saydam bir renk. Iyi yumurta almaya sağlamak için, balık tesisi gelen ışıklar sonra ilk 2 saat boyunca onları toplamak. Yumurta kuruma önlemek için kapalı tutun.
   5. Yumurta, sperm UV süspansiyon 30-50 ul pipet ucu ile hafifçe karıştırın.
   6. Acilly balık suyun yaklaşık 1 ml ekleyin ve zamanlayıcı başlayın. Bu noktada geliştirmek için sol Yumurta haploids olacaktır.
6. . Erken Basınç Not: adımları ag gübreleme 90 saniye içinde gerçekleştirilebilir olmalıdır!
   1. Yumurta, su ilavesi ile aktive olan o anda Sayacı başlat
   2. Birkaç dakika bekleyin ve çanak merkezine daha fazla su, girdap yumurta ekleyin.
   3. Cut-off ve cilalı Pasteur pipeti kullanarak, basınç şişeleri döllenmiş yumurta transferi.
   4. Gerekirse neredeyse bir su şişeleri dudak boncuk bırakarak, taşan şişeleri, böylece daha fazla yumurta su ekleyin.
   5. Su boncuk üzerinde bir lastik top yerleştirin ve lastik üzerindeki plastik kapak güvenli.
   6. Dolum silindir yumurta daha su ekleyerek, ters basınç silindiri flakon (lar) yerleştirin. Güvenli bir şekilde en üst silindir koyun.
   7. , Piston ile basın silindir koyun ve 8.000 lbs / sq geçerlidir. in.
   8. Aktivasyon zaman sonra 6 dakika kadar (basınç 4.5 dakika, toplam süre) basın silindir bırakın.
   9. 6 dakika sonra aktivasyon, basın silindir kaldırmak ve silindir şişeleri kaldırmak. Şişeleri embriyoların soğutma önlemek için dikkatli bir şekilde kurulayın.
   10. Silindir ve yumurta su ile dolum sıfırlayın.
   11. Gerektiği şekilde kısmen yumurta su ile doldurarak bir sonraki şişeleri hazırlayın.
   12. Yumurta tüm partiler için tekrarlayın.

NOT: Silindir bir defada 3 şişe yapacak, bu yüzden yumurta döllenme gecikme zaten tricaine diğer kadın yumurta verirseniz birkaç dakika görmek isteyebilirsiniz. Bu, bir seferde daha fazla gruplar halinde tedavi hız şeyleri yardımcı olacaktır. Ayrıca, bir kez basın tricaine herhangi bir tedavi tamamlanana kadar daha fazla balık koymayın kullanılmaktadır hatırlıyorum. Anestezi kalmak için balık çok uzun onları öldürmek izin vermek. İkincisi, basın edilirken balık sıkmak ve yumurta almak durumunda, basın tekrar kullanılabilir zaman uygulanabilir olması için çok kuru olabilir.

Discussion

Bu yöntemle üretilen embriyolar, gerçek gynogenetic diploitler olduğundan emin olmak için çok önemlidir. Kontrol grubu olarak normal diploid yumurta (UV inaktivasyon olmadan bazı sperm kenara tutmak) ve haploid embriyolar (AP prosedür yoluyla gitmeden UV sperm ile döllenmiş yumurta, bir debriyaj kenara tutarak) bir kavrama, bir debriyaj oluşturur. 1 gün sonrası döllenme haploid embriyolar azından kısa bir vücut ekseni, düzensiz beyin ve hücre gruplarının morfoloji var. Haploids 2-3 gün sonra canlı değildir. EP diploitler bazı düzensiz "EP canavarlar" oluşabilir rağmen, normal diploitler gibi görünmelidir. EP diploitler Manşonlar (% 70-90) büyük ölçüde geçerli olmalıdır. EP diploid debriyaj haploids varlığı EP süreci (örneğin, basınç tutmak için başarısız basın) bir hata göstermektedir. Haploid debriyaj diploitler varlığı eksik sperm inaktivasyonu (örneğin çapraz bağlayıcı bir başarısızlık) göstermektedir.

EP diploitler gen-sentromer mesafeler ¹ ileri genetik ekranları ^4,6 olarak tespit harita mutantlar belirlemek için kullanılır olmuştur. İleri EP diploid embriyo ekranlar hem erken ve daha sonraki gelişim süreçlerinde ilgili genleri tanımlamak için etkili bir yoldur ve bugün ^5,7 kullanılmaktadır.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine	Sigma-Aldrich
Watch glass
French Press
Pressure cylinder
Instant ocean
Pasteur pipettes			Cut off the narrow end, fire polish
UV cross-linker
microcapillaries