Summary
Detta är en metod för att generera gynogenetic embryon diploida sebrafisk (embryon vars enda genetiska bidrag kommer från mamman) genom att blockera den andra meiotiska divisionen omedelbart efter befruktningen med ultraviolett ljus-inaktiverat spermier. EP embryon är inte helt homozygot på grund av rekombination under första meiotiska divisionen, men de är homozygota alls loci som inte har skilts från sina centromer genom rekombination.
Abstract
Heterozygositet i diploid eukaryoter gör ofta genetiska studier besvärligt. Metoder som ger livskraftiga homozygot diploida avkomma direkt från heterozygota honor gör F1 mutagenized kvinnor att vara skärmade direkt skadliga mutationer i en snabbare framåt genetiska skärmen. Streisinger et al.
Protocol
Översikt över tidiga trycket
Obs: recept för många av de reagenser som används i detta protokoll som tricaine, fisk vatten och Hanks saltlösning finns tillgängliga online i kapitel 10 i Zebrafish Bok 3 ( http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html )
- Producera embryon genom befruktning in vitro med UV-inaktiverat spermier.
- Överför omedelbart de befruktade äggen till en injektionsflaska av glas (med en plast snäpplock) fylld till brädden med ägg vatten. Täck den öppna delen av flaskan med en tunn plåt av latex gummi och knäpp den övre (i vilken ett hål skurits) på flaskan över gummi.
- Placera flaskan i en hydraulisk press och på 1,4 minuter efter befruktningen höja trycket till 8000 psi (Observera att många pressar är kalibrerade för att läsa trycket på en 2-tums diameter kolv och avläsningar måste konverteras till psi)
- Början på 6 minuter efter befruktning, gradvis släppa trycket över en period på 1 min.
Detaljerad tidigt trycket förfarande
- Dagen före försöket
- Sent på eftermiddagen, för att separera män och kvinnor pressas. Varje gammal hane kan användas eftersom han inte kommer att bidra genetiskt material. Kvinnor ska se stora och fett i magen. Manlig ska se gult och Spry.
- Håll honor och hanar för sig över natten i spillvattentank där de kan lätt nås på morgonen.
- Morgon av experiment
- Förbered Hanks lösning, lägga natriumbikarbonat.
- Ta för fisk anläggning: ishink, Hanks, Tricaine, timer, rör för att samla sperma.
- Späd Tricaine i fisk vattnet
- Samla spermier
- Förbered en klar injektionsflaska med Hanks lösningen på is. Mät ~ 50 l per hane som ska pressas.
- Bedöva 3 eller 4 hanar i taget genom nedsänkning i tricaine. De kan lyftas ur om bedövningen med en plastsked.
- Skölj i fisk vatten och torka "fuktig-dry" på en pappershandduk (mycket viktigt: vatten aktiverar spermier).
- Montera fisk i en skum hållare under ett stereomikroskop vid låg förstoring med epi-belysning. Separera bukfenor med pincett och placera en microcapillary vid öppnandet av kloak.
- Stroke sidorna av fisken försiktigt men bestämt med jämna (Millipore) peang.
- Som mjölkig spermier komma ut i underlivet pore, samla det i microcapillary med skonsam sugkraft.
- Pool spermierna från flera hanar i iskallt Hanks koksaltlösning. Spermier från 5 till 10 hanar är tillräcklig för befruktning av flera hundra ägg. Spermier i kallt Hanks vilja fortsätta att befrukta ägg effektivt i flera timmar eller dagar. "Eyeball" koncentrationen av spermier, samla in tillräckligt för att göra en grumlig suspension.
- UV inaktivera spermier
- Fyll botten av ett glas petriskål med is.
- Sätt ett klockglas ovanpå isen i skålen.
- Med hjälp av en Pasteur pipett spermierna från provröret på klockglas. Var noga med att få så mycket av spermier i pipetten som möjligt utan att ta upp eventuella bubblor av luft med den. Också, inte bubbla spermierna i klockglas som du utvisa dem från pipetten. Utvisa spermier i ett tunt, jämnt lager på urglas. Kassera denna pipett.
- Placera petriskål i ett UV cross-länkare
- Slå på crosslinker i 2 minuter
- Med en ren pipett, ta bort spermier från klockglas och överföra den till ett Eppendorf-rör märkt UV Spermier och lägg på is.
- Insamling av ägg och provrörsbefruktning
- Bedöva tre eller fyra honor i taget i tricaine.
- Skölj i fisk vatten och torka "fuktig-dry" på en pappershandduk. Överskott av vatten kommer att svälla äggen och förhindra befruktning.
- Placera honan i ett 35 mm plast petriskål med fuktig (inte våt) fingrar, tryck försiktigt men bestämt på magen. Om hon är beredd att lägga ägg, kommer de att komma ut helt enkelt.
- Samla ägg med en spatel och tillbaka hona till vattnet. Bra ägg är en gulaktig, genomskinlig färg, medan ägg som har varit i den kvinnliga alltför länge är vita och vattnig (se nedan). För att säkerställa få bra ägg, samla ihop dem under de första 2 timmarna efter lamporna tänds i fisken anläggningen. Håll äggen täckas för att förhindra uttorkning.
- Tillsätt 30-50 l av UV spermier suspension till äggen och rör försiktigt med pipettspetsen.
- Omedelbarly tillsätt ca 1 ml av fisk vatten och starta timern. Ägg kvar att utveckla på denna punkt kommer att haploids.
- . Tidig Tryck Obs! Steg AG måste utföras inom 90 sekunder efter befruktningen!
- Starta timer vid tillfället att ägg aktiveras genom tillsats av vatten
- Vänta en liten stund och tillsätt mer vatten, snurra ägg till mitten av skålen.
- Med hjälp av en cut-off och polerade Pasteur pipett de befruktade äggen till trycket flaskor.
- Om så behövs, tillsätt mer ägg vatten till rören så att de nästan svämmar över, vilket lämnar en sträng av vatten vid kanten av flaskorna.
- Placera en gummiproppen över pärla av vatten och säkra plastlocket över gummi.
- Placera flaskan (s) upp och ner i tryckcylindern, lägga till fler ägg vatten att fylla på cylindern. Sätt upp på cylindern ordentligt.
- Placera cylindern i pressen med kolven upp och tillämpa £ 8000 / kvm. i.
- Låt cylindern i pressen förrän 6 minuter efter tidpunkten för aktivering (för en total tid på 4,5 min för tryck).
- Vid 6 minuter efter aktivering, ta bort cylindern från pressen, och ta ut flaskorna från cylindern. Försiktigt torka flaskorna för att förhindra avkylning av embryon.
- Återställ cylindern och fyll den med ägg vatten.
- Förbered nästa flaskorna genom att delvis fylla dem med ägg vatten efter behov.
- Upprepa för alla partier av ägg.
OBS: cylindern kommer att hålla upp till tre flaskor på en gång, så du kanske vill fördröja befruktning av ägg några minuter för att se om andra honor redan i tricaine ge ägg. Detta kommer att hjälpa till att snabba upp saker och ting genom att behandla flera partier samtidigt. Kom också ihåg när pressen används inte lägga in mer fisk i tricaine tills behandlingen är avslutad. Att låta fisken att stanna kvar i narkos för länge kan döda dem. Andra, om du pressa fisken när pressen är som används, och få ägg, kan de vara för torrt för att vara lönsamma med tiden pressen kan användas igen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är viktigt att se till att embryon produceras av denna metod är sant gynogenetic diploider. Som kontroller generera en koppling av normala diploida ägg (genom att hålla undan en del av spermierna utan UV-inaktivering) och en klunga haploida embryon (genom att hålla undan en hög med ägg befruktas med UV spermier utan att gå via Europaparlamentets förfarande). Vid en befruktning dag efter haploida embryon har en kort kropp axel, oregelbundna hjärnan och somit morfologi. Haploids inte är livskraftiga efter 2-3 dagar. EP diploider ska se ut vanliga diploider, även om vissa oregelbundna "EP monster" kan förekomma. Kopplingar av EP diploider bör till stor del (70-90%) livskraftiga. Förekomsten av haploids i Europaparlamentet diploid kopplingen föreslår ett fel i EP-processen (till exempel pressen att inte hålla trycket). Förekomsten av diploider i haploida kopplingen föreslår ofullständig spermier inaktivering (till exempel ett fel i crosslinker).
EP diploider har använts för att bestämma gen-centromer avstånd 1 för att kartlägga mutanter som identifieras i framåt genetiska skärmar 4,6. Framåt skärmar av EP diploida embryon är ett effektivt sätt att identifiera gener som är involverade i både tidiga och senare utvecklingsprocesser och används idag 5,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Metoder för provrörsbefruktning och diploider gynogenetic utvecklades för zebrafisk av Charline Walker i George Streisinger labb vid University of Oregon i 1970-talet och 1980-talet. Metoden som beskrivs här är oförändrat jämfört med Charline s protokoll som finns tillgängliga i sin helhet i Zebrafish Book 3.
Metoder för provrörsbefruktning och diploider gynogenetic utvecklades för zebrafisk av Charline Walker i George Streisinger labb vid University of Oregon i 1970-talet och 1980-talet. Metoden som beskrivs här är oförändrat jämfört med Charline s protokoll som finns tillgängliga i sin helhet i Zebrafish Book 3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | ||
| Watch glass | |||
| French Press | |||
| Pressure cylinder | |||
| Instant ocean | |||
| Pasteur pipettes | Cut off the narrow end, fire polish | ||
| UV cross-linker | |||
| microcapillaries |
References
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
