Summary
C'est une méthode pour générer des embryons de poisson zèbre gynogénétiques diploïde (embryons dont la seule contribution génétique vient de la mère) en bloquant la seconde division méiotique immédiatement après la fécondation avec la lumière ultraviolette inactivé sperme. EP embryons ne sont pas entièrement homozygotes due à la recombinaison lors de la première division méiotique, cependant elles sont homozygotes à tous les loci qui n'ont pas été séparés de leur centromère par recombinaison.
Abstract
Hétérozygotie chez les eucaryotes diploïdes fait souvent des études génétiques lourdes. Les méthodes qui produisent des descendants viables diploïdes homozygotes directement à partir de femelles hétérozygotes permettent F1 femelles mutagénisées à être projeté directement mutations délétères dans un écran accélérée avant génétique. Streisinger et al.
Protocol
Aperçu de la pression de début
Remarque: Les recettes pour la plupart des réactifs utilisés dans ce protocole tel que tricaïne, poissons d'eau salée et Hanks sont disponibles en ligne dans le chapitre 10 du Livre Zebrafish 3 ( http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html )
- Produire des embryons par fécondation in vitro en utilisant le sperme UV inactivé.
- Transférer immédiatement les oeufs fécondés dans un flacon en verre (avec un plafond pression en plastique) rempli à ras bord avec de l'eau d'œuf. Couvrir l'extrémité ouverte du flacon avec une mince feuille de latex de caoutchouc et enclenchez le haut (dans lequel un trou a été coupé) sur le flacon sur le caoutchouc.
- Placer le flacon dans une presse hydraulique et à 1,4 min après la fécondation augmenter la pression à 8000 psi (Notez que les presses nombreuses sont calibrés pour lire la pression exercée sur un piston de diamètre de 2 pouces, et les lectures doivent être convertis en psi)
- Début à 6 min après la fécondation, libèrent graduellement la pression sur une période de 1 min.
Détail procédure de la pression au début
- Jour avant l'expérience
- En fin d'après midi, les mâles et les femelles séparés pour être pressé. Tout vieux mâle peut être utilisé car il ne sera pas contribué du matériel génétique. Les femelles doivent chercher de grandes et de graisse dans le ventre. Les mâles doivent chercher jaune et Spry.
- Tenez femelles et les mâles séparément pour la nuit dans des réservoirs où ils peuvent être facilement accessibles dans la matinée.
- Matin d'expérience
- Préparer la solution de Hanks, ajouter le bicarbonate de sodium.
- Apportez à la facilité de poissons: seau à glace, Hanks, tricaïne, minuterie, les tubes de collecte de sperme.
- Diluer dans de l'eau des poissons tricaïne
- Recueillir le sperme
- Préparer un flacon transparent d'une solution de Hanks sur la glace. Mesure ~ 50 ul par des hommes à être pressé.
- Anesthetize 3 ou 4 mâles à la fois par immersion dans tricaïne. Ils peuvent être sorti de l'anesthésie avec une cuillère en plastique.
- Rincer à l'eau les poissons et épongez «humide-sèche" sur une serviette en papier (très important: l'eau actionne des spermatozoïdes).
- Mont de poisson dans un porte-mousse sous un stéréomicroscope à faible grossissement avec épi-illumination. Séparez les nageoires pelviennes avec une pince et la position d'un microcapillaire à l'ouverture du cloaque.
- Course sur les côtés du poisson doucement mais fermement avec douceur (Millipore) forceps.
- Comme le sperme laiteux sortir du pore génital, le recueillir dans le microcapillaire en utilisant une aspiration douce.
- Piscine du sperme de plusieurs mâles dans une solution saline glacée de Hank. Le sperme des mâles de 50 à 10 est suffisant pour la fécondation de plusieurs centaines d'oeufs. Le sperme dans un froid Hanks va continuer à fertiliser les œufs efficacement pendant plusieurs heures voire plusieurs jours. "Eyeball" la concentration des spermatozoïdes, la collecte assez pour faire une suspension trouble.
- UV inactiver les spermatozoïdes
- Remplissez le fond d'un plat en verre de Pétri avec de la glace.
- Mettez un verre de montre sur le dessus de la glace dans le plat.
- En utilisant une pipette Pasteur, transférer le sperme de l'éprouvette sur le verre de montre. Soyez sûr d'obtenir autant de sperme dans la pipette que possible sans prendre toutes les bulles d'air avec elle. Aussi, ne pas la bulle du sperme dans le verre de montre que vous êtes les expulser de la pipette. Expulser des spermatozoïdes dans une fine couche sur le verre de montre. JETER cette pipette.
- Placez la boîte de Pétri dans une UV réticulant
- Allumez le réticulant pendant 2 minutes
- Utiliser une pipette propre, enlever le sperme du verre de montre et de le transférer dans un tube Eppendorf a marqué sperme UV et placer sur la glace.
- Collecte des oeufs et de la fécondation in vitro
- Anesthetize trois ou quatre femelles à la fois dans tricaïne.
- Rincer à l'eau les poissons et épongez «humide-sèche" sur une serviette en papier. L'excès d'eau va gonfler les oeufs et empêcher la fécondation.
- Placer la femelle dans un 35 mm en plastique et des boîtes de Pétri avec un linge humide (pas mouillé) doigts, appuyez doucement mais fermement sur le ventre. Si elle est prête à pondre, ils sortiront facilement.
- Rassemblez les oeufs avec une spatule et retourner à la femelle de l'eau. Bonne oeufs sont un aspect jaunâtre, couleur translucide, tandis que les œufs qui sont restés dans la femelle trop long sont blancs et aqueux (voir ci-dessous). Pour assurer une bonne obtenir des œufs, les recueillir durant les 2 premières heures après les lumières s'allument dans l'établissement de poissons. Gardez les oeufs couverts pour éviter le dessèchement.
- Ajouter 30 à 50 pi de la suspension de spermatozoïdes UV pour les œufs, mélanger délicatement avec la pointe de pipette.
- ImmédiateLy ajouter environ 1 ml d'eau les poissons et démarrage de la minuterie. Oeufs de gauche à se développer à ce point sera haploïdes.
- . Pression Early Remarque: les étapes AG doit être accomplie dans les 90 secondes de la fécondation!
- Démarrer minuterie au moment où les œufs sont activés par l'ajout d'eau
- Attendez quelques instants et ajouter plus d'eau, tourbillon les oeufs au centre du plat.
- En utilisant une teneur de coupure et poli pipette Pasteur, transférer les oeufs fécondés pour les flacons de pression.
- Si nécessaire, ajoutez de l'eau plus d'œufs sur les flacons de sorte qu'ils sont presque débordante, laissant une perle d'eau à la lèvre des flacons.
- Placez un bouchon en caoutchouc sur la perle d'eau et fermer le couvercle en plastique sur le caoutchouc.
- Placer le flacon (s) à l'envers dans le cylindre de pression, en ajoutant de l'eau plus d'œufs pour remplir le cylindre. Mettre le dessus sur le cylindre en toute sécurité.
- Placer le cylindre dans la presse avec le piston et appliquer £ 8,000 / m². po
- Laisser le cylindre dans la presse jusqu'à 6 min après le moment de l'activation (pour un temps total de 4,5 min de pression).
- A 6 minutes après l'activation, retirer le cylindre de la presse, et sortir les flacons du cylindre. Séchez soigneusement les flacons pour éviter le refroidissement de l'embryon.
- Réinitialiser le cylindre et le remplir avec de l'eau d'œuf.
- Préparer les flacons prochaine partiellement les remplir avec de l'eau d'œuf, au besoin.
- Répétez l'opération pour tous les lots d'œufs.
NOTE: Le cylindre peut contenir jusqu'à 3 flacons à la fois, de sorte que vous voudrez peut-être de retarder la fécondation des œufs de quelques minutes pour voir si d'autres femmes déjà dans la tricaïne donnent des oeufs. Cela aidera à accélérer les choses en traitant plusieurs lots en même temps. Aussi, n'oubliez pas une fois la presse est utilisée ne mettez pas plus de poissons dans la tricaïne jusqu'à ce que le traitement est terminé. Permettant aux poissons de rester dans l'anesthésie trop longtemps peut les tuer. Deuxièmement, si vous pressez le poisson alors que la presse est utilisée, et obtenir des œufs, ils peuvent être trop sec pour être viable au moment où la presse peut être utilisée de nouveau.
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Discussion
Il est important de s'assurer que les embryons produits par cette méthode sont diploïdes gynogénétiques vrai. Comme contrôles, de générer une couvée d'oeufs diploïdes normales (en gardant de côté certaines de sperme sans UV-inactivation) et un embrayage d'embryons haploïdes (en gardant de côté une couvée d'oeufs fécondés avec le sperme UV sans passer par la procédure du PE). Au 1er embryons après la fécondation haploïde jour ont un axe corps court, le cerveau et la morphologie irrégulière somites. Haploïdes ne sont pas viables au bout de 2-3 jours. Diploïdes PE devrait ressembler diploïdes normales, bien que certains en situation irrégulière »monstres EP" peuvent se produire. Embrayages de diploïdes PE devrait être largement (70-90%) viables. La présence des haploïdes dans l'embrayage diploïde PE suggère un échec dans le processus de PE (par exemple, la presse ne tenant pas de pression). La présence de diploïdes dans l'embrayage haploïdes suggère l'inactivation du sperme incomplète (par exemple une défaillance de l'agent de reticulation).
Diploïdes EP ont été utilisés pour déterminer gène-centromère distances de 1 à Plan mutants identifiés dans l'avant cribles génétiques 4,6. Forward écrans d'embryons diploïdes EP sont un moyen efficace pour identifier les gènes impliqués dans les processus à la fois précoce et tardive de développement et sont utilisés aujourd'hui 5,7.
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Acknowledgments
Les méthodes de fécondation in vitro et diploïdes gynogénétiques ont été développés pour le poisson-zèbre par Charline Walker dans le laboratoire de George Streisinger à l'Université de l'Oregon dans les années 1970 et 1980. La méthode décrite ici est inchangé par rapport à des protocoles Charline, qui sont disponibles dans leur intégralité dans le Livre Zebrafish 3.
Les méthodes de fécondation in vitro et diploïdes gynogénétiques ont été développés pour le poisson-zèbre par Charline Walker dans le laboratoire de George Streisinger à l'Université de l'Oregon dans les années 1970 et 1980. La méthode décrite ici est inchangé par rapport à des protocoles Charline, qui sont disponibles dans leur intégralité dans le Livre Zebrafish 3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | ||
| Watch glass | |||
| French Press | |||
| Pressure cylinder | |||
| Instant ocean | |||
| Pasteur pipettes | Cut off the narrow end, fire polish | ||
| UV cross-linker | |||
| microcapillaries |
References
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
