初压雌核发育二倍体的斑马鱼

Summary

这是一个产生阻塞后，立即用紫外线灭活精子受精的第二次减数分裂雌核发育二倍体斑马鱼的胚胎（仅来自母亲的遗传贡献的胚胎）的方法。 EP胚胎是不完全纯合的，由于在第一次减数分裂重组，但他们是在所有尚未从他们的着丝粒分离，通过重组位点纯合子。

Abstract

二倍体真核生物的杂合性，往往使繁琐的遗传研究。从杂合子女性产生直接可行的纯合二倍体后代的方法，让有害突变，直接在加速向前遗传屏幕的F1诱变女性进行甄别。 Streisinger等人。

Protocol

初压概述

注：很多，如tricaine，鱼水和生理盐水汉克斯在此协议中所使用的试剂配方是在第10章在网上提供的斑马^鱼的书 3 （http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html）

1. 生产用紫外线灭活精子体外受精的胚胎。
2. 充满蛋水的边缘玻璃小瓶（塑料管理单元第）立即将受精卵。盖与乳胶薄板小瓶打开，并捕捉到小瓶在橡胶的顶部（在其中一个洞已被切断）。
3. 在液压机的小瓶，在受精后的1.4分钟提高到8000磅（请注意，许多印刷机校准读一个直径为2英寸的活塞上施加的压力，读数必须被转换为PSI）的压力
4. 受精后6分钟开始，逐渐释放超过1分钟内的压力。

详细的初压过程

1. 实验前一天
   1. 在下午晚些时候，单独的男性和女性受到挤压。可用于任何岁男性，因为他不会是导致遗传物质。女性应该看看大和脂肪在腹部。男性应该看黄色和Spry。
   2. 保持男性和女性分别持有坦克在那里他们可以很容易地在今天上午访问通宵。
2. 实验的早晨
   1. 准备Hanks液，添加碳酸氢钠。
   2. 到鱼设施：冰桶，汉克斯，Tricaine，定时收集精​​子，管。
   3. 在鱼水稀释Tricaine
3. 收集精子
   1. 准备一个明确汉克斯的解决方案上的冰小瓶。测量〜50％男性μL受到挤压。
   2. 一次麻醉tricaine浸泡3或4个男性。他们可以解除麻醉剂用塑料勺。
   3. 鱼水冲洗和纸巾上（非常重要：水激活精子）的印迹“潮湿的干”。
   4. 安装与外延，照度低倍率的体视显微镜下一个泡沫的持有人在一个鱼。用血管钳分离的腹鳍和定位在一个microcapillary泄殖腔开幕。
   5. 中风的双方顺利（Millipore公司）钳轻轻但坚决鱼。
   6. 由于乳白色的精子来的生殖孔，收集在使用轻柔吸microcapillary。
   7. 游泳池从冰冷的汉克的生理盐水几个男性的精子。从5-10男性的精子是足够的几百个卵受精。精子在寒冷的汉克斯将继续有效施肥几个小时甚至几天的鸡蛋。 “眼球”的精子浓度，收集到足以使阴天悬挂。
4. 紫外线灭活精子
   1. 用冰填充的玻璃培养皿的底部。
   2. 在盘子里，放在冰的顶部表面玻璃。
   3. 使用巴斯德吸管，从试管中转移到精子的表面玻璃。要确保它没有采取任何空气气泡的精子进入移液器尽可能。另外，不要泡在精子的表面玻璃，你从吸管中，他们驱逐。驱逐薄，甚至手表玻璃层的精子。丢弃这个移液器。
   4. 放入培养皿中的紫外线交联剂
   5. 打开2分钟的交联剂
   6. 使用干净的吸管，卸下从表面玻璃的精子，并转移到Eppendorf管标志着紫外线精子置于冰上。
5. 蛋的收集和体外授精
   1. 麻醉在三个或四个女性​​在tricaine。
   2. 鱼水冲洗和印迹在纸巾上的“潮湿的干”。多余的水分会胀大的鸡蛋和防止受精。
   3. 放置在一个35毫米的塑料培养皿中，用湿布（不湿）手指的女性，按肚皮上轻轻地但坚决。如果她是准备产卵，他们会很容易出来。
   4. 用抹刀收集鸡蛋和水返回的女性。优良的受精卵是淡黄色，半透明的颜色，而仍然在女性的卵子过长是白色和水样（见下文）。为了确保获得优良的受精卵，他们收集来的鱼设施上的灯后，在第2小时。保持覆盖，以防止干燥鸡蛋。
   5. 加入30-50μl紫外线精子悬液的鸡蛋，轻轻搅拌枪头。
   6. 立即LY增加鱼水约1毫升，并启动定时器。左侧的发展在这一点上的鸡蛋会单倍体。
6. 。初压请注意：步骤股份公司必须在90秒施肥内完成 ！
   1. 在时刻的计时器开始，鸡蛋加水激活
   2. 稍等片刻，并添加更多的水，漩涡的蛋盘的中心。
   3. 使用切断和抛光的巴斯德吸管，受精卵转移压力瓶。
   4. 如果需要，添加更多的鸡蛋水的小瓶，使他们几乎满溢，留在小瓶唇的水珠。
   5. 放置在水珠的橡胶顶部，并确保在橡胶塑料盖。
   6. 将小瓶（S）倒挂的压力缸，加入更多的蛋水，以补充气缸。安全放在气缸顶部。
   7. 将在报刊与柱塞缸和申请8,000磅/平方。英寸
   8. 6分钟后激活时的总时间4.5分钟的压力，直到记者离开缸。
   9. 在6分钟后激活，从按删除缸，从缸中删除的小瓶。仔细干燥瓶，以防止冷却的胚胎。
   10. 复位气缸和填充它与鸡蛋水。
   11. 准备部分填补他们需要用鸡蛋水未来的小瓶。
   12. 重复所有批次的鸡蛋。

注：气缸将于3瓶一次，所以你可能要延迟几分钟，看看已经在tricaine其他女性鸡蛋的蛋受精。这将有助于加快速度，在同一时间处理多批次。此外，请记住一旦正在使用的记者不要把tricaine在任何更多的鱼，直到治疗完成。让鱼留在麻醉时间过长，可以杀死他们。其次，如果你挤的鱼，而记者正在使用，并获得鸡蛋，他们可能会过于干燥可行的记者，可再次使用时。

Discussion

重要的是要确保用这种方法产生的胚胎，是真正的雌核发育二倍体。作为对照，产生了正常的二倍体卵子（保持预留一些无紫外线灭活精子）和单倍体胚胎（保持不通过EP程序预留的紫外线精子受精卵离合器）离合器的离合器。在1天受精后单倍体胚胎体轴短，不规则的脑和体节的形态。单倍体是不是可行，经过2-3天。 EP二倍体应该看起来像正常的二倍体，虽然一些不规则的“EP怪物”可能会发生。离合器的EP二倍体应主要是可行的（70-90％）。 EP二倍体离合器单倍体的存在表明一个在EP过程（例如，记者未能守住压力）失败。二倍体单倍体离合器的存在表明了不完整的精子失活（例如在交联剂的失败）。

EP二倍体已被用来确定在前进^4,6遗传筛选确定的地图突变体基因着丝粒^距离 1 。远期EP二倍体胚胎的画面是一种有效的方式，以确定在早期和后来的发展过程中所涉及的基因，并^正在使用的今天5,7。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine	Sigma-Aldrich
Watch glass
French Press
Pressure cylinder
Instant ocean
Pasteur pipettes			Cut off the narrow end, fire polish
UV cross-linker
microcapillaries