Summary
Dies ist ein Verfahren zur Erzeugung gynogenetic diploid Zebrafischembryonen (Embryonen, deren einzige genetische Beitrag kommt von der Mutter) durch die Blockierung der zweiten Reifeteilung unmittelbar nach der Befruchtung mit UV-Licht-inaktivierten Sperma. EP Embryonen sind nicht vollständig homozygot durch Rekombination während der ersten meiotischen Teilung, aber sie sind homozygot überhaupt loci, die nicht von ihrem Zentromer wurden durch Rekombination getrennt.
Abstract
Heterozygotie in diploiden Eukaryoten macht oft genetische Studien umständlich. Methoden, die lebensfähige homozygoten diploiden Nachkommen zu erzeugen direkt aus heterozygoten Weibchen ermöglichen F1 mutagenisierten Weibchen direkt für schädliche Mutationen gescreent werden in einem beschleunigten freuen genetische Bildschirm. Streisinger et al.
Protocol
Übersicht der frühen Druck
Hinweis: Rezepte für viele der Reagenzien in diesem Protokoll wie Tricaine, Fisch Wasser und Hanks Kochsalzlösung verwendet sind online verfügbar in Kapitel 10 des Zebrafisch-Buch 3 ( http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html )
- Produce Embryonen durch künstliche Befruchtung mittels UV-inaktivierte Spermien.
- Unmittelbar Übertragung der befruchteten Eizellen zu einem Glasfläschchen (mit einer Kunststoff-Schnappdeckel) bis zum Rand gefüllt mit Ei Wasser. Decken Sie die offene Ende des Röhrchens mit einer dünnen Schicht von Latex und rasten Sie die Oberseite (in die ein Loch geschnitten wurde) auf die Flasche über den Gummi.
- Legen Sie die Flasche in eine hydraulische Presse und bei 1,4 min nach der Befruchtung zu erhöhen den Druck zu 8.000 psi (Beachten Sie, dass viele Maschinen kalibriert werden, um den Druck auf einem 2-Zoll-Durchmesser Kolben ausgeübt zu lesen, und Lesungen müssen psi umgewandelt werden)
- Beginnend bei 6 min nach der Befruchtung allmählich den Druck über einen Zeitraum von 1 min.
Detaillierte frühen Druck Verfahren
- Am Tag vor Experiment
- Am späten Nachmittag, zu trennen Männchen und Weibchen gequetscht werden. Alle alten Männchen kann verwendet werden, da er nicht beitragen wird genetisches Material sein. Frauen achten sollten groß und fett in den Bauch. Männer achten sollten gelb und spry.
- Halten Sie Frauen und Männer getrennt über Nacht in Vorratstanks, wo sie leicht in den Morgen zugegriffen werden kann.
- Am Morgen des Experiments
- Bereiten Hanks Lösung, fügen Natriumbicarbonat.
- Bringen Sie zum Fischen Einrichtung: Eiskübel, Hanks, Tricaine, Timer, Rohre für das Sammeln Spermien.
- Verdünnen Tricaine in Fischwasser
- Sammeln Spermien
- Bereiten Sie eine klare Flasche Hanks-Lösung auf Eis. Measure ~ 50 ul pro Stecker auf gequetscht werden.
- Anesthetize 3 oder 4 Männer in einer Zeit, durch Eintauchen in Tricaine. Sie können aus der Narkose aufgehoben werden mit einem Plastiklöffel.
- Spülen in Fisch abspülen und "feucht-trocken" auf einem Papiertuch (sehr wichtig: Wasser aktiviert Spermien).
- Berg Fisch in einem Schaum Halter unter einem Stereomikroskop bei geringer Vergrößerung mit Auflicht. Trennen Sie die Bauchflossen mit einer Pinzette und die Position einer Mikrokapillare bei der Eröffnung der Kloake.
- Streicheln Sie die Seiten des Fisches vorsichtig, aber fest mit glatten (Millipore) Pinzette.
- Da die milchige Sperma aus der Geschlechtsöffnung kommen, sammeln sie in die Mikrokapillare mit sanftem Sog.
- Pool der Spermien von mehreren Männchen in eiskaltem Hanks Salzlösung. Sperm 5 bis 10 Männern ist ausreichend für die Befruchtung von mehreren hundert Eier. Sperma in kalten Hanks ist weiterhin Eier befruchten effizient für mehrere Stunden oder sogar Tage. "Eyeball" die Konzentration der Spermien, Sammeln genug, um eine trübe Suspension zu machen.
- UV inaktiviert Sperma
- Füllen Sie den Boden eines Glases Petrischale mit Eis.
- Setzen Sie ein Uhrglas auf dem Eis in der Schüssel.
- Mit einer Pasteur Pipette die Spermien aus dem Reagenzglas auf dem Uhrglas. Achten Sie darauf, wie viel der Spermien in die Pipette wie möglich zu erhalten, ohne dass sich keine Luftblasen mit ihm. Auch nicht-Blase die Spermien in dem Uhrglas, wie du bist vertrieben sie aus der Pipette. Expel Spermien in eine dünne, gleichmäßige Schicht auf Uhrglas. DISCARD dieser Pipette.
- Legen Sie die Petrischale in eine UV-Vernetzer
- Schalten Sie Vernetzer für 2 Minuten
- Mit einem sauberen Pipette, entfernen Sie die Spermien aus dem Uhrglas und überträgt es auf ein Eppendorf-Röhrchen markiert UV Sperma und auf Eis stellen.
- Eiersammlung und in-vitro-Fertilisation
- Anesthetize drei oder vier Frauen in einer Zeit, in Tricaine.
- Spülen in Fisch abspülen und "feucht-trocken" auf einem Papiertuch. Überschüssiges Wasser quillt die Eier und verhindern, dass die Befruchtung.
- Legen Sie die Frau in einem 35 mm Petrischale aus Kunststoff und mit einem feuchten (nicht nassen) Finger, vorsichtig, aber fest auf den Bauch drücken. Wenn sie bereit ist, Eier zu legen, werden sie kommen aus ganz leicht.
- Sammeln Sie die Eier mit einem Spatel und gibt die Frau zu Wasser. Gute Eier sind gelblich, durchscheinend Farbe, während Eier, die in der weiblichen blieb zu lange weiß und wässrig sind (siehe unten). Um zu gewährleisten, erhalten Sie ein gutes Eiern, sammeln sie während der ersten 2 Stunden nach die Lichter angehen in der Fisch-Anlage. Keep Eiern bedeckt, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Add 30-50 ul des UV Spermiensuspension, um die Eier, rühren Sie vorsichtig mit Pipettenspitze.
- Unmittelbarly hinzuzufügen ca. 1 ml der Fische Wasser und Start-Timer. Eier links an dieser Stelle entwickeln Haploiden werden.
- . Frühe Pressure Hinweis: Schritte ag innerhalb von 90 Sekunden nach der Befruchtung vollzogen sein muss!
- Starte Zeit bei Moment, dass Eier durch die Zugabe von Wasser aktiviert werden
- Warten Sie einen Moment, und fügen Sie mehr Wasser, wirbeln die Eier in die Mitte des Tellers.
- Unter Anwendung eines Cut-off und poliert Pasteur Pipette die befruchteten Eier, um den Druck abgefüllt.
- Wenn nötig, fügen Sie mehr Ei Wasser die Fläschchen, so dass sie fast überfüllt sind, so dass eine Perle von Wasser an der Lippe des Vials.
- Legen Sie eine Gummi-Spitze über den Wulst aus Wasser und befestigen Sie die Kunststoff-Deckel über den Gummi.
- Legen Sie die Durchstechflasche (n) den Kopf in den Druckzylinder, indem mehr Ei Wasser zum Nachfüllen des Zylinders. Legen Sie die oben auf dem Zylinder fest.
- Setzen Sie den Zylinder in der Presse mit dem Stempel auf und gelten £ 8.000 / sq. in.
- Lassen Sie den Zylinder in der Presse bis 6 min nach dem Zeitpunkt der Aktivierung (für eine Gesamtzeit von 4,5 min Druck).
- Bei 6 min nach der Aktivierung, entfernen Sie den Zylinder aus der Presse, und entfernen Sie das Fläschchen aus dem Zylinder. Vorsichtig trocken die Fläschchen, um die Kühlung des Embryos zu verhindern.
- Setzen Sie den Zylinder ab und füllen es mit Ei Wasser.
- Bereiten Sie das nächste Fläschchen durch teilweises Füllen sie mit Ei Wasser als nötig.
- Wiederholen Sie dies für alle Chargen von Eiern.
Hinweis: Der Zylinder kann bis zu 3 Fläschchen zu einer Zeit, so möchten Sie vielleicht die Befruchtung der Eier ein paar Minuten zu sehen, ob andere Frauen bereits in der Tricaine geben Eier zu verzögern. Dies wird dazu beitragen die Dinge zu beschleunigen, indem man mehrere Partien auf einmal. Denken Sie auch daran, wenn die Presse verwendet wird stellen Sie keine mehr Fische in den Tricaine, bis die Behandlung abgeschlossen ist. Fisch gestatten in der Narkose zu lange kann sie töten. Zweitens, wenn Sie Fisch Squeeze, während die Presse verwendet wird, und erhalten Sie Eier, können sie zu trocken, um durch die Zeit der Presse wieder verwendet werden kann lebensfähig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass Embryonen nach diesem Verfahren hergestellten wahre gynogenetic Diploiden sind. Als Kontrollen erzeugen eine Kupplung von normalen diploiden Eier (indem sie beiseite einige der Spermien ohne UV-Inaktivierung) und eine Kupplung von haploiden Embryonen (indem sie beiseite ein Gelege von Eiern mit UV Spermium befruchtet, ohne durch die EP-Verfahren). An 1 Tag nach der Befruchtung haploide Embryonen haben einen kurzen Körper Achse, unregelmäßige Gehirn und Somiten Morphologie. Haploiden nicht nach 2-3 Tagen lebensfähig. EP Diploiden sollten wie normale diploide aussehen, obwohl einige unregelmäßige "EP Monster" auftreten. Kupplungen von EP Diploiden sollte weitgehend (70-90%) lebensfähig. Die Anwesenheit von Haploiden in der EP diploid Kupplung schlägt ein Fehler in der EP-Verfahren (zum Beispiel die Presse andernfalls auf Druck halten). Die Anwesenheit von Diploiden in der haploiden Kupplung schlägt unvollständig Spermien Inaktivierung (zum Beispiel ein Fehler in der Vernetzer).
EP Diploiden wurden verwendet, um Gen-Centromer Entfernungen 1 bis Karte Mutanten in den zukunftsgerichteten genetischen Screens 4,6 identifiziert zu bestimmen. Vorwärts-Bildschirme von EP diploiden Embryonen sind ein effizienter Weg, um Gene in der frühen und späteren Entwicklungsprozessen beteiligt zu identifizieren und werden heute 5,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Verfahren zur in-vitro-Fertilisation und gynogenetic Diploiden wurden Zebrafisch von Charline Walker in George Streisinger Labor an der University of Oregon in den 1970er und 1980er Jahren entwickelt. Die hier beschriebene Methode ist unverändert von Charline die Protokolle, die verfügbar sind in voller Höhe in der Zebrafisch Book 3.
Verfahren zur in-vitro-Fertilisation und gynogenetic Diploiden wurden Zebrafisch von Charline Walker in George Streisinger Labor an der University of Oregon in den 1970er und 1980er Jahren entwickelt. Die hier beschriebene Methode ist unverändert von Charline die Protokolle, die verfügbar sind in voller Höhe in der Zebrafisch Book 3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | ||
| Watch glass | |||
| French Press | |||
| Pressure cylinder | |||
| Instant ocean | |||
| Pasteur pipettes | Cut off the narrow end, fire polish | ||
| UV cross-linker | |||
| microcapillaries |
References
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
