ביצוע דיפלואידי דג הזברה Gynogenetic על ידי לחץ מוקדמת

Summary

זוהי שיטה להפקת דיפלואידי gynogenetic עוברי דג הזברה (אשר עוברים רק תרומה גנטית מגיע מהאם) על ידי חסימת חלוקת meiotic מחרה מחזיק אחריה מיד לאחר ההפריה עם זרע אור אולטרה סגול מומת. עוברים EP אינם הומוזיגוטים במלואה עקב רקומבינציה במהלך החלוקה meiotic הראשון, אולם הם הומוזיגוטים בכלל לוקוסים שלא היה מופרד centromere שלהם על ידי רקומבינציה.

Abstract

Heterozygosity אאוקריוטים דיפלואידי לעתים קרובות גורם מחקרים גנטיים מסורבלת. שיטות המייצרים דיפלואידי קיימא צאצאים הומוזיגוטים ישירות מן הנקבות הטרוזיגוטיים לאפשר לנשים mutagenized F1 כדי להיות מוקרן ישירות למסך גנטי קדימה מואצת מוטציות מזיקות. Streisinger et al.

Protocol

סקירה כללית של לחץ מוקדם

הערה: מתכונים רבים של חומרים כימיים המשמשים פרוטוקול זה כמו tricaine מים, דגים מלוחים הנקס זמינים באופן מקוון בפרק 10 של הספר דג הזברה ³ ( http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html )

1. תוצרת העוברים על ידי הפריה חוץ גופית באמצעות זרע מומת UV.
2. מיד להעביר את הביציות המופרות כדי בקבוקון זכוכית (עם כובע הצמד פלסטיק) מלאה עד גדותיה במים ביצה. מכסים את הקצה הפתוח של הבקבוקון עם סדין דק של לטקס גומי הצמד העליון (שלתוכו חור נחתך) על הבקבוקון על הגומי.
3. מניחים את הבקבוקון בעיתונות הידראולי ב 1.4 דקות לאחר ההפריה להעלות את הלחץ 8,000 psi (שים לב לוחץ רבים מכוילים לקרוא את הלחץ המופעל על בוכנה 2 אינץ' קוטר, וקריאה חייב להיות מומר psi)
4. החל בשעה 6 דקות לאחר ההפריה, בהדרגה לשחרר את הלחץ על פני תקופה של דקות 1.

בתחילת הליך מפורט לחץ

1. יום לפני הניסוי
   1. בשעות אחר הצהריים המאוחרות, זכרים ונקבות נפרדים להיות לחצה. כל בן זכר יכול לשמש מאז הוא לא יהיה תורם החומר הגנטי. נקבות צריך להיראות גדולים שומן בבטן. זכרים צריך להיראות צהוב מלא חיים.
   2. החזק נשים וגברים לילה בנפרד מחזיק טנקים שבו הם יכולים לגשת בקלות בבוקר.
2. בוקר של הניסוי
   1. הכן פתרון הנקס; להוסיף סודיום ביקרבונט.
   2. מביאים מתקן דגים: דלי קרח, הנקס, Tricaine, טיימר, שפופרות לאיסוף הזרע.
   3. Tricaine מדולל במים דגים
3. איסוף הזרע
   1. הכנת בקבוקון ברורה של פתרון הנקס על הקרח. מדוד ~ 50 μl לכל זכר להתמצות.
   2. הרדימי 3 או 4 גברים בכל פעם על ידי טבילה tricaine. הם יכולים להיות הרים מתוך ההרדמה בכפית פלסטיק.
   3. לשטוף במים דגים כתם "רטוב יבש" על מגבת נייר (חשוב מאוד: מפעיל זרע מים).
   4. הר דג בעל קצף תחת stereomicroscope בהגדלה נמוכה עם עלית תאורה. הפרד את סנפירי גחון עם מלקחיים בעמדה microcapillary בפתיחת הביב.
   5. שבץ את הצדדים של הדג בעדינות אך בתקיפות עם חלקה (Millipore) מלקחיים.
   6. כמו זרע חלבי לצאת נקבובית המין, לאסוף אותו microcapillary באמצעות שאיבה עדינה.
   7. בריכת זרע מהזכרים מספר מלוחים קר כקרח של האנק. זרע מהזכרים 50-10 היא נאותה להפריה של כמה מאות ביצים. הזרע בקור של הנקס ימשיך להפרות ביציות ביעילות במשך כמה שעות או אפילו ימים. "גלגל העין" ריכוז הזרע, איסוף מספיק כדי לעשות השעיה מעונן.
4. UV להשבית זרע
   1. ממלאים את תחתית צלחת פטרי כוס עם קרח.
   2. שים watchglass על גבי קרח בצלחת.
   3. בעזרת פיפטה פסטר, להעביר את הזרע במבחנה על watchglass. הקפידו להגיע כמה שיותר הזרע לתוך פיפטה ככל האפשר בלי לקחת את כל בועות האוויר עם זה. כמו כן, אין בועת זרע watchglass כפי שאתה לגרש אותם מן פיפטה. לגרש הזרע שכבה דקה אפילו, על זכוכית השעון. לבטל את זה פיפטה.
   4. מניחים את צלחת פטרי לתוך UV צולבות linker
   5. הפעל crosslinker 2 דקות
   6. בעזרת פיפטה CLEAN, להסיר את זרע watchglass ולהעביר אותו צינור הזרע Eppendorf מסומן מקום UV ו על הקרח.
5. אוסף ביצה הפריה במבחנה
   1. הרדימי שלוש או ארבע נקבות בכל פעם tricaine.
   2. לשטוף במים דגים כתם "רטוב יבש" על מגבת נייר. עודף מים יתנפחו את הביצים למנוע הפריה.
   3. המקום הנשי צלחת פלסטיק 35 מ"מ פטרי עם לחה) לא רטובה (אצבעות, לחצו בעדינות אך בתקיפות על הבטן. אם היא מוכנה להטיל ביצים, הם ייצאו די בקלות.
   4. אסוף את הביצים עם מרית וחוזרים הנשי למים. ביצים טובות הן בצבע צהבהב, שקוף, בעוד הביצים נשארו הנקבה יותר מדי זמן לבנות ומימיות (ראה להלן). כדי להבטיח מקבל ביצים טוב, לאסוף אותם במהלך 2 השעות הראשונות לאחר האורות לבוא במתקן דגים. שמור על הביצים מכוסה כדי למנוע ייבוש החוצה.
   5. הוסף 30-50 μl של ההשעיה זרע UV על הביצים, מערבבים בעדינות עם קצה פיפטה.
   6. מידיly להוסיף כ - 1 מ"ל של מים ודגים ולהתחיל טיימר. ביצים שמאל לפתח בשלב זה יהיה haploids.
6. . הלחץ מוקדם הערה: צעדים AG חייב להתבצע בתוך 90 שניות של הפריה!
   1. הפעלת טיימר באותו רגע ביצים מופעלים על ידי תוספת של מים
   2. חכו כמה דקות ומוסיפים עוד מים, לערבל את הביצים במרכז המנה.
   3. שימוש חתוכים ומלוטשים פיפטה פסטר, להעביר את הביציות המופרות על צלוחיות הלחץ.
   4. אם יש צורך, מוסיפים מים ביצה יותר מבחנות, כך הם כמעט עולה על גדותיו, משאיר טיפה של מים על שפת צלוחיות.
   5. מניחים על גבי גומי חרוז מים לאבטח את מכסה הפלסטיק מעל הגומי.
   6. מניחים את הבקבוקון (ים) במהופך בצילינדר בלחץ, הוספת מים ביצה יותר כדי למלא את המיכל. שים את הדף על הגליל מאובטח.
   7. מניחים את גליל בעיתונות עם הבוכנה מעלה להחיל £ 8,000 / מ"ר. פנימה
   8. השאירו את גליל בעיתונות עד 6 דקות אחרי זמן ההפעלה (זמן כולל של 4.5 דקות של לחץ).
   9. בשעה 6 דקות לאחר ההפעלה, להסיר את גליל מהעיתונות, ולהסיר את בקבוקוני מהגליל. בזהירות לייבש את בקבוקוני כדי למנוע קירור של העוברים.
   10. איפוס גליל ולמלא אותה במים ביצה.
   11. הכן את בקבוקוני הבא חלקית על ידי מילוי אותם עם מים ביצה לפי הצורך.
   12. חזור לכל קבוצות של ביצים.

הערה: גליל תקיים עד 3 מבחנות בכל פעם, כך שאולי תרצה לדחות את ההפריה של הביצים כמה דקות כדי לראות אם נקבות אחרות כבר tricaine לתת ביצים. זה יעזור לזרז את הדברים על ידי טיפול בקבוצות יותר בבת אחת. כמו כן, זוכר שפעם העיתונות נמצא בשימוש, לא לשים דגים יותר tricaine עד השלמת הטיפול. מתן דגים להישאר ההרדמה יותר מדי זמן יכול להרוג אותם. שנית, אם אתה לסחוט דגים ואילו העיתונות נמצאת בשימוש, ולקבל ביצים, הם עשויים להיות יבשים מדי כדי להיות בת קיימא עד שהעיתונות ניתן להשתמש שוב.

Discussion

חשוב לוודא כי עוברי המיוצר על ידי שיטה זו diploids gynogenetic נכון. כמו שולטת, ליצור מקבץ הביצים דיפלואידי נורמלי (על ידי שמירה על הצידה כמה זרע ללא איון-UV) ואת המצמד של עוברים הפלואידים (על ידי שמירה בצד מקבץ של ביציות מופרות עם זרע UV מבלי לעבור דרך ההליך EP). ב 1 הודעה יום עוברים הפריה הפלואידים יש ציר גוף קצר, המוח לא סדיר מורפולוגיה somite. Haploids אינם קיימא לאחר 2-3 ימים. Diploids EP אמור להיראות diploids נורמלי, למרות שחלקם לא סדיר "מפלצות EP" עלולה להתרחש. לופתת של diploids EP צריך להיות במידה רבה (70-90%) בת קיימא. הנוכחות של haploids את המצמד דיפלואידי EP מציע כשל בתהליך EP (למשל, העיתונות הכושלת להחזיק הלחץ). הנוכחות של diploids את המצמד הפלואידים מציע איון זרע שלם (לדוגמה כשל crosslinker).

Diploids EP שימשו כדי לקבוע גנים centromere מרחקים ¹ עד מוטנטים המפה מזוהה קדימה מסכי גנטי ^4,6. קדימה מסכי עוברים EP דיפלואידי הם דרך יעילה לזיהוי גנים המעורבים בתהליכים הן מוקדם התפתחותי מאוחר יותר, נמצאים בשימוש היום ^5,7.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine	Sigma-Aldrich
Watch glass
French Press
Pressure cylinder
Instant ocean
Pasteur pipettes			Cut off the narrow end, fire polish
UV cross-linker
microcapillaries