Summary
Это метод генерации гиногенетических диплоидных эмбрионов данио рерио (эмбрионы, единственный генетический вклад происходит от матери), блокируя второго деления мейоза сразу после оплодотворения ультрафиолетовым светом инактивированная сперма. EP эмбрионы не являются полностью гомозиготных из-за рекомбинации во время первого деления мейоза, однако они гомозиготных по всем локусам, которые не были отделены от их центромеры рекомбинации.
Abstract
Гетерозиготности диплоидных эукариот часто делает генетические исследования громоздким. Методы, которые производят жизнеспособные диплоидные гомозиготные потомства непосредственно от гетерозиготных женщин позволяют F1 мутагенизированных женщин пройти обследование непосредственно для вредных мутаций в ускоренном вперед генетические экране. Streisinger и соавт.
Protocol
Обзор ранних давления
Примечание: рецепты для многих из реагентов, используемых в этом протоколе, такие как tricaine, рыбу водой и солевым Хэнкс можно ознакомиться в Интернете в главе 10 данио рерио Книга 3 ( http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html )
- Продукция эмбрионов путем экстракорпорального оплодотворения с помощью УФ инактивированная сперма.
- Сразу же передаче оплодотворенных яйцеклеток, чтобы стекло флакона (с пластиковой крышкой оснастки), заполненной до краев яйцом воды. Обложка открытый конец флакон с тонким слоем латекса каучука и оснастки верхней (в которую отверстие было сокращено) на флакон над резиной.
- Место флаконе в гидравлическом прессе и на 1,4 мин после оплодотворения поднять давление до 8000 фунтов на квадратный дюйм (Обратите внимание, что многие прессы откалиброваны читать давление на 2-дюймовый диаметр поршня, и показания должны быть преобразованы в пси)
- Начиная с 6 мин после оплодотворения, постепенно выпустить давление в течение 1 мин.
Подробные процедуры раннего давления
- За день до эксперимента
- Во второй половине дня, отдельно мужчины и женщины находиться под давлением. Любой старый самец может быть использован, так как он не будет участвовать генетического материала. Женщины должны выглядеть большими и жира в животе. Мужчины должны выглядеть желтым и живой.
- Держите самок и самцов отдельно на ночь в проведении танки, где они могут быть легко доступны в первой половине дня.
- Утро эксперимент
- Подготовка Хэнкс решение, добавить бикарбонат натрия.
- Довести до рыбы объекте: ведерко со льдом, Хэнкс, Tricaine, таймер, трубы для сбора спермы.
- Развести Tricaine в рыбе воду
- Сбор спермы
- Подготовка ясно флакон Хэнкс решение на льду. Мера ~ 50 мкл на мужской находиться под давлением.
- Обезболить 3 или 4 мужчины в то время, путем погружения в tricaine. Они могут быть избавлены от анестезии с пластмассовой ложкой.
- Промыть рыбу в воду и промокните "влажный-сухой" на бумажное полотенце (очень важно: сперма вода активизирует).
- Горы рыбы в пену держатель под стереомикроскопа при низких увеличение с эпи-подсветкой. Отдельные брюшные плавники щипцами и положение микрокапиллярных на открытии клоаку.
- Инсульт сторон рыбу мягко, но твердо с гладкой (Millipore) щипцами.
- Как молочно спермы выйти из полового отверстия, собрать ее в микрокапиллярных использованием деликатного всасывания.
- Бассейн спермы от нескольких мужчин в физиологическом растворе ледяной Хэнка. Сперма мужчин с 5-10 вполне достаточно для оплодотворения нескольких сотен яиц. Сперма в холодной Хэнкс будет продолжаться, чтобы оплодотворить яйца эффективно в течение нескольких часов или даже дней. "Глазное яблоко" концентрация спермы, собирая достаточно, чтобы сделать облачно подвески.
- УФ-инактивации спермы
- Заполните нижнюю часть стеклянной посуде Петри со льдом.
- Положите препаратного стекла поверх льда в блюдо.
- С помощью пипетки Пастера, передача спермы из пробирки на препаратного стекла. Будьте уверены, чтобы получить как можно больше спермы в пипетку возможно, не занимая какой-либо пузырьки воздуха с ним. Кроме того, не пузыря сперму в препаратного стекла, как вы исключении их из пипетки. Выгнать спермы в тонком, даже слой на стекле часы. Сбросьте эту пипетки.
- Место чашке Петри в УФ поперечных связей
- Включите сшивающий агент в течение 2 минут
- Используя чистую пипетку, удалите спермы препаратного стекла и перенести его на трубку Eppendorf отмеченные УФ спермы и место на льду.
- Сбор яиц и экстракорпоральное оплодотворение
- Обезболить три или четыре женщины в то время, в tricaine.
- Промыть рыбу в воду и промокните "влажный-сухой" на бумажном полотенце. Избыток воды увеличится яйца и предотвращения оплодотворения.
- Место женщины в 35 мм блюдо пластиковой Петри и влажной (не мокрой) пальцев, пресс мягко, но твердо на живот. Если она готова отложить яйца, они выйдут довольно легко.
- Сбор яиц с помощью шпателя и возвращение женщин к воде. Хорошие яйца желтоватый, прозрачный цвет, в то время как яйца, которые остались в женском слишком длинный белый и водянистый (см. ниже). Для обеспечения получения хорошего яйца, собирать их в течение первых 2 часов после огни давай в рыбе объекта. Храните яйца покрыты для предотвращения высыхания.
- Добавить 30-50 мкл УФ подвески спермы яйца, размешать осторожно кончиком пипетки.
- НемедленныйLy добавить около 1 мл воды и рыбы начинают таймер. Яйца левой развиваться на данном этапе будет гаплоидов.
- . Ранние давления Примечание: шаги AG должны быть выполнены в течение 90 секунд оплодотворения!
- Запустить таймер в момент времени, что яйца активируются добавления воды
- Подождите несколько минут и добавить больше воды, водоворот яйца в центр блюда.
- Использование отсечения и полированный пипетки Пастера перенести оплодотворенных яйцеклеток, чтобы давление ампул.
- Если нужно, добавьте яйцо больше воды флаконах, так что они почти переполнены, в результате чего шарик воды в губу ампул.
- Место резиновые топ за борт воды и безопасной пластиковой крышкой над резиной.
- Место флакон (ы) с ног на голову в цилиндре давление, добавляя больше воды яйцо пополнить цилиндра. Положите сверху на цилиндр надежно.
- Место цилиндра в прессе с поршнем и применять 8000 фунтов / кв. дюйм
- Оставьте цилиндр в прессе до 6 минут после времени активации (для общего времени в 4,5 мин давление).
- Через 6 мин после активации, снимите цилиндр от прессы, и удалить флаконы из цилиндра. Тщательно высушите флаконах, чтобы предотвратить охлаждение эмбрионов.
- Сброс цилиндр и пополнить его с яйцом воды.
- Подготовка следующего флаконах частично наполняя их яйца водой по мере необходимости.
- Повторите эти действия для всех партий яйца.
ПРИМЕЧАНИЕ: цилиндр будет проводить до 3 флаконов в то время, так что вы можете отложить оплодотворение яиц несколько минут, чтобы увидеть, если другие самки уже в tricaine дают яйца. Это поможет ускорить процесс, рассматривая несколько пакетов в одно время. Кроме того, помню, как однажды пресса используется не ставьте больше рыбы в tricaine до завершения курса лечения. Разрешение рыбы, чтобы остаться в анестезией слишком долго может убить их. Во-вторых, если ты держишь рыбу в то время как пресса используется, и получить яйца, они могут быть слишком сухой, чтобы быть жизнеспособным к тому времени, пресса может быть использован повторно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важно, чтобы убедиться, что эмбрион, полученный с помощью этого метода верны диплоиды гиногенетических. В качестве контроля генерировать сцепление нормальных диплоидных яиц (в сторону, сохраняя некоторые из спермы без УФ-инактивации) и сцепление гаплоидных эмбрионов (в сторону, сохраняя сцепление яйца оплодотворены спермой УФ минуя процедуру EP). На 1 день после оплодотворения эмбрионы имеют гаплоидный короткой оси тела, мозга и нерегулярные сомитов морфологии. Гаплоидов не являются жизнеспособными через 2-3 дня. EP диплоиды должна выглядеть нормальная диплоиды, хотя некоторые нерегулярные "EP монстров" может произойти. Муфты из диплоиды ЕР должно быть в значительной степени (70-90%) жизнеспособным. Наличие гаплоидов в сцеплением диплоидных ЕР предлагает сбой в процессе EP (например, пресса не в состоянии держать давление). Наличие диплоиды в гаплоидных сцепление предлагает неполной инактивации спермы (например, сбой в сшивателя).
EP диплоиды были использованы для определения генов центромеры расстояния от 1 до карту мутантов определены в прямом генетических экранов 4,6. Форвард экраны эмбрионов EP диплоидных являются эффективным способом для выявления генов, участвующих в обоих ранних и поздних процессов развития и используются сегодня 5,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Методы искусственного оплодотворения и гиногенетических диплоиды были разработаны для рыбок данио по Charline Уокер в лаборатории Джорджа Streisinger в Университете штата Орегон в 1970-х и 1980-х. Метод, описанный здесь не претерпела изменений с протоколами Charline, которые доступны в полном объеме в Книгу данио рерио 3.
Методы искусственного оплодотворения и гиногенетических диплоиды были разработаны для рыбок данио по Charline Уокер в лаборатории Джорджа Streisinger в Университете штата Орегон в 1970-х и 1980-х. Метод, описанный здесь не претерпела изменений с протоколами Charline, которые доступны в полном объеме в Книгу данио рерио 3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | ||
| Watch glass | |||
| French Press | |||
| Pressure cylinder | |||
| Instant ocean | |||
| Pasteur pipettes | Cut off the narrow end, fire polish | ||
| UV cross-linker | |||
| microcapillaries |
References
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
