Summary
Este es un método para la generación de embriones de pez cebra gynogenetic diploide (embriones, cuya única contribución genética proviene de la madre) por el bloqueo de la segunda división meiótica inmediatamente después de la fertilización con luz ultravioleta inactiva los espermatozoides. EP embriones no son totalmente homocigotos debido a la recombinación en la primera división meiótica, sin embargo, son homocigotos en todos los lugares que no han sido separados de sus centrómero por recombinación.
Abstract
Heterocigosidad en eucariotas diploides a menudo hace que los estudios genéticos engorroso. Métodos que producen descendencia viable diploides homocigóticos directamente de las mujeres heterocigotas permite F1 hembras mutadas que se proyectarán directamente de mutaciones deletéreas en una pantalla acelerado avance genético. Streisinger et al.
Protocol
Resumen de la presión a principios
Nota: las recetas de muchos de los reactivos utilizados en este protocolo, como tricaína, peces de agua y solución salina Hanks están disponibles en línea en el capítulo 10 del Libro de pez cebra 3 ( http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html )
- Producir embriones por fecundación in vitro con esperma inactivado UV.
- Inmediatamente la transferencia de los óvulos fertilizados en un frasco de vidrio (con un tapón de presión de plástico) lleno hasta el borde con agua del huevo. Tapar el extremo abierto de la ampolla con una fina capa de látex de caucho y encaje la parte superior (en la que un agujero se ha reducido) en el vial sobre el caucho.
- Coloque el vial en una prensa hidráulica y en el 1,4 min después de la fertilización aumentar la presión a 8000 psi (Tenga en cuenta que muchas máquinas están calibradas para leer la presión ejercida sobre un pistón de 2 pulgadas de diámetro, y las lecturas deben ser convertidos a psi)
- A partir de los 6 minutos después de la fecundación, liberar la presión gradualmente durante un período de 1 min.
Procedimiento detallado presión inicial
- Día antes del experimento
- Por la tarde, los hombres y mujeres por separado para ser exprimidos. Cualquier hombre de edad se puede utilizar ya que no estará contribuyendo material genético. Las mujeres deben parecer grande y la grasa en el vientre. Los machos deben tener un color amarillento y ágil.
- Mantenga mujeres y hombres por separado durante la noche en los tanques donde se puede acceder fácilmente por la mañana.
- Mañana del experimento
- Prepare una solución de Hanks, añadir bicarbonato de sodio.
- Llevar a la instalación de los peces: cubo de hielo, Hanks, tricaína, contador de tiempo, los tubos de recogida de esperma.
- Diluir tricaína en peces de agua
- Recoger el esperma
- Prepare un frasco transparente de la solución de Hanks en el hielo. Medida ~ 50 l por hombres que se apretó.
- Anestesiar a 3 ó 4 hombres a la vez por la inmersión en tricaína. Que se pueden levantar de la anestesia con una cuchara de plástico.
- Enjuague con agua y secar pescado "húmedo-seco" en una toalla de papel (muy importante: el agua de esperma activa).
- Monte de pescado en un soporte de espuma bajo un microscopio estereoscópico a bajo aumento con epi-iluminación. Separar las aletas pélvicas con una pinza y una posición microcapilar en la apertura de la cloaca.
- Accidente cerebrovascular de los lados del pescado con cuidado pero con firmeza, con suave (Millipore) con fórceps.
- Mientras que la esperma lechosa salir del poro genital, que se acumulan en el capilar se utiliza una succión suave.
- La piscina del esperma de varios machos en una solución salina helada de Hank. Esperma de los machos 50-10 es la adecuada para la fecundación de varios cientos de huevos. Esperma en frío Hanks seguirá para fertilizar los óvulos de manera eficiente por varias horas o incluso días. "Ojo" de la concentración de espermatozoides, recogiendo lo suficiente como para hacer una suspensión turbia.
- UV inactivar los espermatozoides
- Llene el fondo de un plato de Petri de vidrio con hielo.
- Poner un vidrio de reloj en la parte superior del hielo en el plato.
- Con una pipeta Pasteur, transferir el esperma de los tubos de ensayo en el vidrio de reloj. Asegúrese de obtener la mayor cantidad de esperma en la pipeta como sea posible sin asumir las burbujas de aire con ella. Además, no se la burbuja de los espermatozoides en el vidrio de reloj a medida que se les expulsa de la pipeta. Expulsar a los espermatozoides en una capa fina y uniforme sobre vidrio de reloj. DESCARTE esta pipeta.
- Coloque la placa de Petri en una UV reticulante
- Encienda el reticulante durante 2 minutos
- Usando una pipeta limpia, eliminar los espermatozoides desde el vidrio de reloj y transferirlo a un tubo eppendorf marcados esperma UV y el lugar en el hielo.
- Recolección de huevos y la fecundación in vitro
- Anestesiar a tres o cuatro mujeres en un momento en tricaína.
- Enjuague con agua y secar pescado "húmedo-seco" en una toalla de papel. El exceso de agua se hinchan los huevos y evitar la fecundación.
- Colocar la hembra en un plato de plástico 35 mm de Petri y con el húmedo (no mojado) los dedos, presione suavemente pero con firmeza en el vientre. Si ella está dispuesta a poner sus huevos, van a salir con bastante facilidad.
- Recolectan los huevos con una espátula y volver a la hembra en el agua. Buenos huevos son de color amarillento, transparente, mientras que los huevos que han permanecido en la mujer demasiado tiempo son blancas y acuosas (ver más abajo). Para asegurarse de obtener buenos huevos, que se acumulan durante las primeras 2 horas después de que las luces se encienden en las instalaciones de los peces. Mantenga los huevos cubiertos para prevenir la desecación.
- Añadir 30-50 l de la suspensión de esperma UV a los huevos, mezclar suavemente con la punta de la pipeta.
- Inmediatomente añadir aproximadamente 1 ml de agua y los peces iniciar el temporizador. Los huevos de izquierda a desarrollar en este punto se haploides.
- . Presión temprano Nota: los pasos ag debe llevarse a cabo dentro de los 90 segundos de la fertilización!
- Iniciar el temporizador en un momento que los huevos son activados por la adición de agua
- Espere unos minutos y agregar más agua, agitar los huevos en el centro del plato.
- Utilizando una línea de corte y pulido pipeta Pasteur, la transferencia de los óvulos fertilizados a los viales de presión.
- Si es necesario, añada más agua de huevos a los viales para que sean casi desbordante, dejando una gota de agua en el borde de los viales.
- Coloque una tapa de goma sobre la gota de agua y asegurar la tapa de plástico sobre la goma.
- Coloque el vial (s) boca abajo en el cilindro de presión, agregando más agua de huevos para volver a llenar el cilindro. Ponga la tapa en el cilindro de forma segura.
- Coloque el cilindro en la prensa con el émbolo y aplicar 8.000 libras / pie cuadrado. in
- Deja la botella en la prensa hasta 6 minutos después de que el momento de la activación (por un tiempo total de 4,5 minutos de presión).
- A los 6 minutos después de la activación, retire el cilindro de la prensa, y retirar los viales del cilindro. Secar cuidadosamente los viales para evitar el enfriamiento de los embriones.
- Restablecer el cilindro y volverlo a llenar con agua los huevos.
- Preparar los viales próximos por parte llenándolos con agua de huevos, según sea necesario.
- Repita este procedimiento para todos los lotes de huevos.
NOTA: El cilindro con capacidad para 3 viales a la vez, por lo que puede retrasar la fertilización de los huevos unos minutos para ver si otras mujeres que ya están en el tricaína dan huevos. Esto ayudará a acelerar las cosas mediante el tratamiento de varios lotes de una sola vez. Además, recuerda una vez que la prensa se está utilizando no poner todos los peces más en el tricaína hasta que se complete el tratamiento. Permitiendo que los peces para mantenerse en la anestesia mucho tiempo puede provocar la muerte. En segundo lugar, si usted aprieta los peces, mientras que la prensa está siendo utilizado, y obtener los huevos, pueden ser demasiado seca para ser viable por el momento se puede volver a utilizar la prensa.
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Discussion
Es importante asegurarse de que los embriones producidos por este método son diploides cierto gynogenetic. Como controles, generar una nidada de huevos diploides normales (al mantener a un lado algunos de los espermatozoides sin UV-inactivación) y un grupo de embriones haploides (por un lado mantener una nidada de huevos fecundados con el esperma de UV, sin pasar por el procedimiento de EP). En un mensaje embriones haploides días de fertilización tienen un eje cuerpo corto, el cerebro y la morfología irregular somite. Haploides no son viables después de 2-3 días. Diploides EP debe verse como diploides normales, aunque algunos irregular "monstruos EP" puede ocurrir. Garras de diploides EP debe en gran parte (70-90%) viable. La presencia de haploides en el embrague diploide PE sugiere una falla en el proceso de EP (por ejemplo, la prensa no para mantener la presión). La presencia de los diploides en el embrague haploides sugiere la inactivación de esperma incompleta (por ejemplo, una falla en el entrecruzamiento).
Diploides EP se han utilizado para determinar el gen-centrómero distancias de 1 a mutantes mapa identificado en adelante pantallas genética 4,6. Adelante pantallas de embriones diploides EP son una forma eficiente de identificar los genes involucrados en los procesos de desarrollo temprano y tarde y están siendo utilizados en la actualidad 5,7.
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Acknowledgments
Los métodos para la fertilización in vitro y diploides gynogenetic fueron desarrollados para el pez cebra por Charline Walker en el laboratorio de George Streisinger en la Universidad de Oregon en los años 1970 y 1980. El método descrito aquí no ha cambiado desde los protocolos de Charline que están disponibles en su totalidad en el Libro de pez cebra 3.
Los métodos para la fertilización in vitro y diploides gynogenetic fueron desarrollados para el pez cebra por Charline Walker en el laboratorio de George Streisinger en la Universidad de Oregon en los años 1970 y 1980. El método descrito aquí no ha cambiado desde los protocolos de Charline que están disponibles en su totalidad en el Libro de pez cebra 3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | ||
| Watch glass | |||
| French Press | |||
| Pressure cylinder | |||
| Instant ocean | |||
| Pasteur pipettes | Cut off the narrow end, fire polish | ||
| UV cross-linker | |||
| microcapillaries |
References
- Streisinger, G. Segregation analyses and gene-centromere distances in zebrafish. Genetics. 112 (2), 311-311 (1986).
- Streisinger, G. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-293 (1981).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Johnson, S. L., Africa, D., Horne, S., Postlethwait, J. H. Half-tetrad analysis in zebrafish: mapping the ros mutation and the centromere of linkage group I. Genetics. 139 (4), 1727-1727 (1995).
- Beattie, C. E., Raible, D. W., Henion, P. D., Eisen, J. S. Early pressure screens. Methods Cell Biol. 237 (71), 2575-25 (1999).
- Johnson, S. L. Centromere-linkage analysis and consolidation of the zebrafish genetic map. Genetics. 142 (4), 1277-1277 (1996).
- Trede, N. S. Zebrafish mutants with disrupted early T-cell and thymus development identified in early pressure screen. Dev Dyn. 237 (9), 2575-2575 (1999).
