Summary
Лектина-сопряженных ПОРОС шарики используются для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Гликопептид стандарты послужили положительные и отрицательные контроли. МАРС-14 исчерпан, трипсин-переваривается человеческой плазмы хроматографировали и проточные (FT) и связанной фракций, собранных для ESI-LC-MS/MS анализов. Гликопептиды обогащались связанной фракции по сравнению с FT.
Abstract
Гликанов являются важным классом пост-трансляционной модификации. Обычно найти на выделяемые и внеклеточных молекул, гликана структуры сигнала внутреннее состояние клеток. Гликанов на опухолевые клетки, как правило, имеют богатый сиаловой кислоты и фукозы фрагментов. Мы полагаем, что это рак связаны гликана вариантов быть использованы для биомаркеров развития, направленные на диагностику ранних стадий заболевания. Соответственно, мы разработали масс-спектрометрии на основе рабочего процесса, который включает хроматографии на близость матрицы, составленные из лектинов, белки, которые связывают специфические структуры гликана. Лектины Бузина черная (СНС) и алейрий aurantia (AAL), которые связываются сиаловой кислоты и фукозы, соответственно, были ковалентно связан с ПОРОС шариков (Applied Biosystems) и упаковывается в PEEK колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Короче говоря, плазма был исчерпан из четырнадцати наиболее распространенных белков, используя несколько системой удаления сродством (МАРС-14; Agilent). Обедненный плазмы трипсин-переваривается и разделить на проточные и связанных фракций СНС или AAL ВЭЖХ. Фракций лечили PNGaseF для удаления N-связанных гликанов, и проанализированы LC-MS/MS на Elite QStar. Данные были проанализированы с помощью талисмана программного обеспечения. Опытно-конструкторских включены положительные контроли-фукозилированных и sialylated человека гликопептидов и лактоферрин отрицательного контроля высокой маннозы гликопептидов с Saccharomyces CEREVISIAE-, которые были использованы для мониторинга специфичность лектина захвата. Основные характеристики этого рабочего процесса включает воспроизводимость происходит от формата ВЭЖХ, положительной идентификации в плен и PNGaseF обработанных гликопептидов от их мотивов deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr и качество оценки с использованием гликопротеина стандартам. Протокол оптимизации также включены определения соответствующего соотношения исходного материала для колонки мощностью, выявление наиболее эффективных захвата и элюции буфера и мониторинга PNGaseF обращения с целью обеспечения полного Дегликозилирование. Будущие направления деятельности включают в себя использование этого рабочего процесса для выполнения масс-спектрометрии основе экспериментов открытие на плазму от больных раком молочной железы и контроль физических лиц.
Protocol
1) Подготовьте лектин-сопряженных ПОРОС столбцов
- Наденьте маску для защиты от вдыхания ПОРОС-AL бисера во время шага 1.1 - 1.2. Отвесить нужное количество бусин ПОРОС (100 мг beads/300 мкл конечного объема) и передача в чистую пробирку Эппендорф.
- Вымойте бисера с добавлением 1 мл фосфатно-солевом буфере (PBS). Гранул бисером центрифугированием в микроцентрифужных на максимальной скорости в течение 3 минут. Удалить супернатант и повторите мыться.
- Отвесить нужное количество неконъюгированного лектина (1 - 4 мг / 200 мкл бусы) и трансфер в чистую пробирку Эппендорф. Добавить PBS для формирования 5 - 20 мг / мл раствора. Резервный 25 мкл этого раствора.
- Передача оставшийся раствор лектина к ПОРОС бисером. Добавить цианоборогидрида натрия в конечной концентрации 50 мМ. Место трубки на рокера и реагировать на ночь при комнатной температуре. (Примечание:. Цианоборогидрида натрия является токсичным и должны быть обработаны в вытяжной шкаф загрязненные отходы должны быть утилизированы соответствующим образом.)
- Гранул ПОРОС бисером, как в пункте 1.2. Удалить супернатант и сохранить как после конъюгации решение.
- Вымойте бисер с 1 мл буфера Тушение (1 М Трис-Cl, рН 7,4). Гранул бисером, как в пункте 1.2 и безопасно отбросить супернатант.
- Блок оставшиеся реактивной сайтов бисером ПОРОС с 1 буфера Тушение мл. Добавить цианоборогидрида натрия в конечной концентрации 50 мМ. Место трубки на рокера и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Гранул бисером, как в пункте 1.2 и отбросить супернатант.
- Вымойте бисер с 1 мл 1 М NaCl. Гранул бисером и отбросить супернатант. Повторите четыре раза для общей сложности пять стирок. Бусины готовы к упаковке.
- Для определения количества белка, что было сопряжено с ПОРОС бусы, выполнять анализ концентрации белка на предварительно сопряженных и пост-сопряженные решения лектина. Различие в концентрациях количество белка, что было сопряжено с бисером. Количество белка в сопряженных бусинка объем равен концентрации лектина на бусы. Целевые концентрации лектина составляют от 2 -20 мг / мл.
2) Упаковка лектин-сопряженных ПОРОС бисером в колонке PEEK
- Сборка системы упаковки (описание ниже) и поддерживать его на подставке металлическим кольцом. Упаковка система состоит из, снизу вверх, давление ограничитель, конец колонки ответвитель 1, фритты, колонки (2 х 50 мм), в конце колонки ответвитель 2, колонка разъем, конец колонки ответвитель 3, колонка (4,5 х 50 мм), конец колонки 4 муфта и конец арматуры. Верхняя колонка служит резервуаром для упаковочного материала.
- Ресуспендируют ПОРОС бусины требуемого объема буфера (10 мМ трис-буфер, рН 7,4, 150 мМ хлорида натрия, 10 мМ хлорида кальция, 10 мМ хлорид магния). Если упаковка одного столбца (~ 200 мкл кровать), ресуспендируют в 400 мкл буфера А.
- Передача сопряженных бисером ПОРОС в верхней колонне (резервуар). Добавить буфера в резервуар, пока буфер достигает верхней части колонны. Аккуратно конце установки на верхней части колонны, стараясь избегать пузырьков воздуха в колонне. Подключите конец установка верхней колонки системы ВЭЖХ.
- Обновления колонки течет буфера через систему. Начните с расходом 0,5 мл / мин. Увеличение скорости потока на 0,5 мл / мин с каждой минутой, пока не 4 мл / мин или максимальное давление (3000 фунтов на квадратный дюйм), была достигнута. Продолжить на максимально возможной скорости потока по крайней мере до 35 мл буфера прошли через колонки.
- Выключите насос и дать давление на колонке, снизится до <20 фунтов на квадратный дюйм.
- Осторожно, не разбирайте упаковки системы, начиная с самого верха. Когда муфта конца столбец 2 будет достигнута, удалить осторожно. Некоторые упакованные материалы должны быть выдавливания из верхней части колонны. С лезвия бритвы или аналогичного острые края, аккуратно вытереть экструзии бусы, оставляя поверхность шва, который даже с верхней части колонны. Не давите на бисер, делая это.
- Отрыв насадочной колонне из кольца стенда. Место новые фритты в новый ответвителя конца и поверните насадочной колонне более связывать это с фритта / конец муфты на открытом (ранее сверху) колонки конца.
- Этикетка колонки соответственно. В настоящее время готова к использованию. Когда вы не пользуетесь, колонки могут храниться в PBS с 0,02% азида натрия при температуре 4 ° С не более 6 месяцев.
3) Программа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
- Подробностями программирования вашего ВЭЖХ будет варьироваться в зависимости от особенностей программного обеспечения фирмы-производителя. Мы используем Paradigm Michrom MG4 ВЭЖХ. На этой машине, методы строятся и доступен в разделе "Настройки", расположенную в верхней части экрана. Программа следующий метод:
Время Расход (мкл / мин) % % B 0:00 50 100 0 9:00 50 100 0 9:01 500 0 100 13:50 500 0 100 13:51 3000 100 0 19:50 3000 100 0
Буфер: 10 мМ трис-буфер, рН 7,4, 150 мМ хлорида натрия, 10 мМ хлорида кальция, 10 мМ хлорид магния
Буфер B: 0,5 М уксусной кислоты
УФ-детектор должен быть запрограммирован на чтение при 280 нм с 0:00 до 19:50. Оси ординат должен быть отрегулирован для обнаружения низких уровней поглощения, например, 0 - 50. АС. - Если автосамплером доступна, программа следующему графику для фракции коллекции. В противном случае, собирают фракции вручную, как указано при выполнении хроматографии.
Фракция Задержка со сбором от образца инъекции Продолжительность сбора (мин) Проточная 2,8 4,1 Связанный 9 2,6
4) Подготовка проб для ВЭЖХ
- Перед использованием в данном протоколе, плазмы крови человека должны быть исчерпаны из 14 наиболее обильных белков на колонке MARS (Agilent, Санта-Клара, Калифорния). Обедненный плазмы, лактоферрина человека и дрожжей инвертазы должны быть индивидуально трипсин-переваривается и обессоленной, как описано выше 1.
- Для подготовки лектина конкретных лактоферрин стандарт, выполняют хроматографии на 50 мкг трипсина-переваренной лактоферрин как за AAL или колонки СНС методом в части 3. Связанной фракции будет содержать лектина конкретных лактоферрин гликопептидов. Нейтрализовать образцов, как в части 4.4 и опреснения, как в части 6. Ресуспендируют образца в 1 мл буфера А. Полученный образец будет готов к использованию.
- Три экспериментальных повторяет будет выполнена. Для подготовки образцов в течение трех повторяет, добавить 3 пмоль трипсина-переваренной инвертазы и 1 мкл лектина конкретных лактоферрин (либо AAL-ЛАК или СНС-ЛАК) до 30 мкл МАРС-истощаются, трипсин-переваривается, плазменные эквиваленты (PE). ПЭ определяется как объем non-processed/intact/original плазмы, из которой данное количество обработанных плазмой (МАРС-истощены и трипсина переваривается) было получено. Добавить буфера в образец для достижения конечного объема 330 мкл.
- Добавить нейтрализации буфера (1 М Трис рН 8,0), к образцу флаконов, что будет собирать элюат. Количество и объем флаконов вы работаете с, будет зависеть от ограничений вашего автоматического пробоотборника. Для Paradigm MG4, один флакон собирает проточные и два сбора элюата. Это потребует примерно 1,5 мл трис-буфера для нейтрализации 1 мл элюата. Целевая нейтрализованы рН 7,0-8,0; тест тест окончательного рН с рН индикаторной бумаги.
5) Выполните хроматографии
- Все пустое и пример работает, следующие будут использовать метод, описанный в Части 1. Столбца и буферы при комнатной температуре при ее использовании. Колонны хранить при температуре 4 ° С, а буферы хранятся при комнатной температуре.
- Прикрепите либо AAL или колонки СНС лектина в систему ВЭЖХ и запустить две пустые методы (потребители инъекционных только буфера). Убедитесь, что лектин столбец соответствует лектина конкретных лактоферрин (Часть 2).
- Хроматограф трех образцов плазмы, потребители инъекционных пустым между каждой инъекции образца, на общую сумму 7 работает ВЭЖХ. Фракции из пустых работает не обязательно должны быть собраны.
6) опреснения собранных фракций
Для каждой фракции использовать один 1 мл воды Оазис HLB SPE картридж следующим образом:
- Прикрепить количество необходимых патронов к вакуумным многообразием.
- Влажные каждый картридж с 1 мл 80% ACN в 1% муравьиной кислоты (вакуумметр на многообразии должны прочитать 5 - 20 lnHg).
- Равновесия патроны с 1,5 мл 0,1% муравьиной кислоты (вакуумметр на многообразии должны прочитать 5 - 20 lnHg)
- Нагрузка весь объем одной пробы на один картридж (Вакуумметр на многообразии должны прочитать 2 - 2.5. LnHg, а скорость потока не должна превышать 1 мл / мин)
- Вымойте патроны с 3 х 1 мл 0,1% муравьиной кислоты (Вакуумметр на многообразии должны прочитать 5 - 20 lnHg)
- Элюции пептидов / гликопептидов в подписанные Эппендорф труб с 1 х 1 мл 80% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоты. (Вакуумметр на многообразии должны прочитать 2 - 2,5 lnHg, а скорость потока не должна превышать 1 мл / мин.) Одной трубой сбор должен быть использован для каждого картриджа.
- Нейтрализовать элюата, добавляя 60 мкл 0,5 М бикарбонат аммония в каждой коллекции трубки. Целевая нейтробобщенные рН является 7,0-8,0; тест окончательного рН с рН индикаторной бумаги.
- Концентрат элюировали пептиды / гликопептидов до ~ 50 мкл, запустив их в вакуумной центрифуге (например, Thermo Savant SpeedVac) для ~ 2 часа при 35 ° C.
7) PNGase F-пищеварение
- Испытание образца рН для обеспечения его между 7,0 - 8,0. Если нужно, добавьте 50 мМ бикарбоната аммония увеличения рН. Если конечный объем пробы> 100 мкл, speedvac образца, пока он находится между 50-100 мкл.
- Добавить 0,5 мкл (250 U) глицерина, свободных F PNGase в каждую пробирку образца и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи.
8) образцы Zip Совет
- Начиная с PNGase F-переваривается образцов, каждый из ziptip следующим образом.
- Влажные ziptip по 10 мкл 100% ацетонитрила, затем 10 мкл 80% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты.
- Равновесия ziptip с 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты.
- Нагрузка на образец ziptip пипетированием его вверх и вниз через матрицу ziptip 10 раз.
- Вымойте ziptip с помощью пипетки 10 мкл 0,1% муравьиной кислоты, 5 раза.
- Элюировать образца в чистую пробирку Эппендорф с 10 мкл 80% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты.
- Повторите элюирования и добавить второй 10 мкл в ту же трубу.
- Speedvac образцы объема <2 мкл.
- Ресуспендируют образцов в 20 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Образцы теперь готовы для анализа LC-MS/MS.
9) представитель Результаты:
Сопряжения ПОРОС обычно дает на борт лектина концентрации в диапазоне 2 - 20 мг / мл. Это оптимально для аффинной хроматографии.
Лектин хроматографии трипсина-переваренной МАРС-обедненного плазме крови человека обычно обогащает гликопептидов в связанной фракции. Как гликопептиды PNGase F обработанных до LC-MS/MS, они идентифицируются как пептиды с N-связанных консенсусной последовательности, NXS / T (где Х-либо остатка, но пролин), в котором аспарагин был преобразован в аспарагиновой кислоты за счет действия PNGase пептиды Ф. с этими характеристиками считаются deglycosylated пептидов (или "deglycopeptides"). В среднем проточные (FT) фракции из AAL или СНС хроматографии содержит 2-4% deglycopeptides, тогда как 30-50% пептидов взысканы в связанной фракции являются deglycopeptides. Как правило, с использованием QStar Elite, 1000-1300 пептиды будут определены во фракции ФТ и 200-400 пептидов, будут определены в связанной фракции. Два или более различных deglycopeptides инвертазы должны соблюдаться во фракции FT и две или более различных deglycopeptides лактоферрина в связанной фракции (табл. 1).
Таблица 1.
Discussion
Этот протокол обеспечивает быстрый метод выделения и идентификации гликопептидов в гликана конкретным образом. Как гликозилирования варьируется широко в организме, особенно в период развития и патогенеза, эта техника может применяться для решения самых разнообразных вопросов. В частности, мы используем метод выборочного обогащения гликопептидов, которые были изменены с раком связаны эпитопы, как первый шаг к открытию биомаркеров.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Клинические протеомных технологий для Рака инициативу, 5U24CA126477-04.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human plasma | We make this in house | ||
| Human lactoferrin | Sigma-Aldrich | L0520 | Trypsin-digest before use |
| Yeast invertase | Sigma-Aldrich | I0408 | Trypsin-digest before use |
| Oass HLB SPE cartridges | Waters | WAT094225 | 1 cc volume |
| ZipTip pipet tips | Fisher Scientific | ZTC1 8M0 96 | Millipore, C18 for 10 ml pipette |
| Tris | Fisher Scientific | BP154-1 | 99% |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | 99% |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 96% |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | 98% |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 242853 | 99.7% |
| pH indicator paper | Fisher Scientific | M95903 | Range 0-14 |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | 99.9% |
| Formic acid | Pierce, Thermo Scientific | 28905 | 99% |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 14190-136 | Without calcium and magnesium |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | 99.5% |
| PNGase F | New England Biolabs | P0705L | Glycerol-free |
| Vacuum-filter flasks | Fisher Scientific | SCGVU05RE | 0.2 mm pores |
| POROS-AL beads | Applied Biosystems | 1-6028-02 | |
| Aleuria aurantia lectin | Vector Laboratories | L-1390 | |
| Sambucus nigra agglutinin | Vector Laboratories | L-1300 | |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296945 | 5.0 M solution |
References
- Keshishian, H. multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution. Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).
