Summary
凝集素结合POROS珠被雇用的高效液相色谱法。糖肽类标准担任阳性和阴性对照。 MARS的14枯竭，胰蛋白酶消化人体血浆层析和流过（FT）和约束分数ESI-LC-MS/MS分析收集。糖肽的富集在绑定的分数相比，FT。
Abstract
聚糖是一类重要的翻译后修饰。通常分泌和细胞外分子中，糖链结构的细胞信号的内部状态。聚糖对肿瘤细胞往往有丰富的唾液酸和岩藻糖基团。我们建议，旨在早期疾病诊断的生物标志物开发利用这些癌症相关聚糖变种。因此，我们开发了质谱为基础的工作流程，采用色谱凝集素，特定的糖链结构的蛋白质结合形成的亲和力矩阵。凝集素接骨木黑（SNA）和Aleuria aurantia（AAL），结合唾液酸和岩藻糖，分别，共价键耦合POROS珠（美国应用生物系统公司），并包装成高压液相色谱（HPLC）的PEEK列。简单地说，等离子消耗使用多重亲和去除系统（MARS - 14;安捷伦）的14个最丰富的蛋白质。贫血浆胰蛋白酶消化成流过约束分数和SNA或AAL高效液相色谱法分隔。的分数均与PNGaseF删除N -连接聚糖，和上一个QSTAR精英的LC-MS/MS分析。使用Mascot软件对数据进行分析。实验设计包括积极控制，fucosylated和唾液酸人乳铁蛋白糖肽和阴性对照组高甘露糖肽酿酒酵母，用于监测特异性的凝集素捕获。这个工作流程的主要功能包括格式的高效液相色谱法，deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr图案的捕获和PNGaseF处理的糖肽的积极识别和使用糖蛋白标准质量评估所得的重复性。协议优化还包括确定适当比例的起始原料，柱容量，找出最有效的捕获和洗脱缓冲液，并监测PNGaseF治疗，以确保充分deglycosylation。未来的方向，包括使用此工作流程执行从乳腺癌患者的血浆和控制个人质谱为基础的发现实验的。
Protocol
1）准备凝集素结合POROS列
- 在步骤1.1 - 1.2，戴上口罩，防止吸入孔隙AL珠保护。称取所需POROS珠的量（100毫克beads/300μL终体积），并转移到一个干净的Eppendorf管。
- 用1毫升磷酸缓冲液（PBS）除珠。在以最大速度离心3分钟离心颗粒珠。取出上清液，重复清洗。
- 称取所需数量未结合凝集素（1 - 4毫克/ 200μL珠），并转移到一个干净的Eppendorf管。加入PBS，形成5 - 20毫克/毫升的溶液。 25μL储备这个解决方案。
- 转移POROS珠其余的外源凝集素的解决方案。添加到终浓度为50毫米的钠氰基。广场上的摇杆管，并在室温下反应过夜。 （注：钠氰基是有毒的，必须在通风柜处理污染废物必须处理适当。）
- 颗粒的步骤1.2 POROS珠。取出上清液并保存后共轭解决方案。
- 用1毫升淬火液（1米，pH值7.4的Tris - CL）珠。在步骤1.2和安全的颗粒珠弃上清。
- 1毫升淬火液座POROS珠其余的活性位点。添加到终浓度为50毫米的钠氰基。广场上的摇杆管，并在室温下孵育30分钟。
- 步骤1.2颗粒珠，弃上清。
- 洗净，用1 mL 1 M氯化钠珠。颗粒珠，弃上清。共5洗，重复四次。珠现正准备收拾。
- 为了确定蛋白质的量，结合POROS珠，进行预共轭后结合凝集素的解决方案中的蛋白浓度测定。浓度不同的是，结合珠蛋白量。每珠卷结合蛋白量等于凝集素珠的浓度。目标凝集素浓度2 -20毫克/毫升之间。
2）包装成一个PEEK柱凝集素结合POROS珠
- 组装的包装系统（描述如下），并支持它在一个金属环的立场。包装系统组成，从底部到顶部，压力限流器，耦合器1，熔块，最终列列（2 × 50毫米），2月底列耦合，列连接器，结束列耦合器3，柱（4.5 × 50毫米），年底列耦合4月底装修。上部列作为包装材料水库。
- 在理想的缓冲液重悬POROS珠一“（10毫米Tris缓冲液，pH值7.4，氯化钠150毫米，10毫米氯化钙，10毫米氯化镁）。如果包装一列（〜200μL床体积），在400μL缓冲液A悬浮
- 转移到上层列共轭POROS珠（藏）。添加缓冲水库，直到缓冲区达到列的顶部。轻轻地放到列的顶部接头，试图避免在列的气泡。上层柱接头连接到HPLC系统。
- 包流经系统的一个缓冲区列。开始用0.5毫升/分的流量。直到4毫升/分钟的最大压力（3000 psi）的已达到增加0.5毫升/分钟，每分钟的流量。在最大可能的流量继续，直到至少35毫升的缓冲区通过列通过。
- 关闭泵，并允许在列上的压力下降到<20 PSI。
- 轻轻地，拆开包装系统，从顶部开始。当最终列耦合器2，仔细去除。一些包装材料应挤出列的顶部。用刀片或类似的锋利的边缘，轻轻擦去挤出的珠子，留下了珠表面，甚至是与列的顶部。不要施加压力，而这样做的珠子。
- 放开柱从环站。放入一个新的终端耦合器的一个新的釉料和填充柱转开放（前顶部）柱端熔块/结束耦合连接。
- 适当的标签列。现在准备使用。在不使用时，列可能存储长达6个月0.02％的叠氮化钠在4 ° C的PBS。
3）计划的高效液相色谱法
- 根据制造商的软件的具体编程的高效液相色谱法的细节会有所不同。我们使用一个Michrom范式MG4高效液相色谱法。这台机器上，方法是建立和在屏幕上方的“设置”标签下访问。计划的以下方法：
时间 流量（μL/ min的） ％A ％B级 0:00 50 100 0 9:00 50 100 0 9:01 500 0 100 十三时50分 500 0 100 13时51分 3000 100 0 十九点50分 3000 100 0
缓冲答：10毫米Tris缓冲液，pH值7.4，150毫米氯化钠，10毫米氯化钙，10毫米氯化镁
缓冲液B：0.5 M的醋酸
紫外检测器应设定在280 nm处读取从0:00到19时50。应调整Y轴，检测低吸光度的水平 ，例如，0 - 50非盟。 - 如果自动进样器，程序馏分收集以下的时间表。否则，收集的分数，表示在表演色谱时。
分数 从进样延迟集合 采集时间（分钟） 流通过 2.8 4.1 展 9 2.6
4）准备样品的HPLC
- 在使用之前，在本议定书，应枯竭使用一个火星的列（美国安捷伦，美国加州圣克拉拉，）14最丰富的蛋白质，人体血浆。贫血浆，人乳铁蛋白和酵母的转化应单独胰蛋白酶消化，脱盐作为先前所描述的 1 。
- 要准备的乳铁蛋白凝集素的具体标准，执行超过50微克胰蛋白酶消化的乳铁蛋白AAL的或使用的方法在第3部分的SNA列色谱。绑定的分数将包含特定的外源凝集素的乳铁蛋白糖肽。中在第6部第4.4的样品，并淡化。悬浮在1 mL缓冲液A的样品，造成样品准备使用。
- 复制将进行三个实验。要准备三个样本复制，添加3 pmol胰蛋白酶消化，转化和1μL凝集素特有的乳铁蛋白（无论是AAL的LAC或SNA - 拉丁美洲和加勒比）30μL火星耗尽，胰蛋白酶消化，血浆现金等价物（PE）。一个PE的定义是non-processed/intact/original从中派生一个处理血浆（MARS耗尽和胰蛋白酶消化）量的血浆量。添加缓冲样品，以达到最终体积330μL。
- 添加和缓冲液（1米的Tris pH值8.0），样品瓶，将收集洗脱液。的数量和你一起工作的小瓶量将取决于您的自动进样器的约束。对于范式MG4，一小瓶收集的流量通过和两个收集洗脱液。这将需要约1.5 mL的Tris缓冲液中1毫升洗脱液。目标瓦解pH值7.0-8.0; pH试纸测试测试的最终pH值。
5）执行色谱
- 所有的空白和样品的运行，将使用第1部分中描述的方法。列和缓冲区是在室温下，同时在使用中。列存储在4 ° C，而缓冲区是在室温下储存。
- 附加的AAL或SNA凝集素列的高效液相色谱系统，并运行两个空白的方法（注一）只能缓冲。确保凝集素列对应的外源凝集素特有的乳铁蛋白（2）。
- 三个血浆样品色谱仪，注射在彼此之间注入样品的空白，共7高效液相色谱法运行。从空白运行的分数不会被收集。
6）脱盐收集馏分
对于每个部分1毫升水域绿洲HLB SPE柱使用如下：
- 将所需的墨盒数量真空歧管。
- 湿用1毫升80％，1％甲酸乙腈（上气歧管的真空压力表应改为5 - 20 lnHg）每个墨盒。
- 平衡与1.5 mL 0.1％的甲酸（上气歧管的真空压力表应读5 - 20 lnHg）墨盒
- 一个样品的整个卷装到一个墨盒（歧管的真空压力表应读2 - 2.5 lnHg，流速不应超过1毫升/分钟）
- 用3 × 1 mL 0.1％的甲酸（上气歧管的真空压力表应读5 - 20 lnHg）墨盒
- 洗脱肽/糖肽标记的1 × 1毫升80％，0.1％甲酸乙腈的Eppendorf管中。 （歧管上的真空计应改为2 - 2.5 lnHg，流速不应超过1毫升/分钟。）一个集合管应为每个碳粉盒使用。
- 中加入60μL0.5 M的碳酸氢铵，每个收集管洗脱液。目标neutralized pH值是7.0-8.0，pH试纸测试的最终pH值。
- 集中真空离心机运行（ 例如，一个热的学者SpeedVac）〜2小时@ 35 ° C〜50μL洗脱肽/糖肽
7）PNGase F -消化
- 测试样品的pH值，以确保它是在7.0 - 8.0之间。如果需要，增加50毫米碳酸氢铵，以提高pH值。如果最终样本量为100μL，speedvac样品，直到它在50-100微升。
- 在37℃过夜，加入0.5μL（250 U）的甘油PNGase F每个样品管和孵化。
8）邮编提示样本
- PNGase F -消化样品开始，每一个如下ziptip。
- 湿ziptip 10μL100％乙腈，10μL80％乙腈，0.1％甲酸。
- 20μL0.1％甲酸平衡ziptip。
- 样品加载到ziptip吹打起来，并通过ziptip矩阵的10倍。
- 吸取10微升0.1％甲酸，5次清洗ziptip。
- 10μL80％乙腈，0.1％甲酸，到一个干净的Eppendorf管流出的样品。
- 重复洗脱，并添加到同一管内的第二次10μL。
- Speedvac体积<2μL的样品。
- 悬浮样品20μL0.1％甲酸。样品现已准备的LC-MS/MS分析。
9）代表性的成果：
POROS共轭通常产生在珠上的外源凝集素的浓度范围为2 - 20毫克/毫升。这是为亲和层析的最佳选择。
胰蛋白酶消化MARS耗尽人血浆中的凝集素层析通常在约束分数丰富的糖肽。由于糖肽PNGase F -治疗前到的LC-MS/MS，他们被认定为与N -连接的共识序列肽，NXS / T（其中X是任何残留物，但脯氨酸），在其中的天冬酰胺已被转换为通过天冬氨酸PNGase楼肽具有这些特性的行动，被认为是deglycosylated肽（或“deglycopeptides”）。平均流量通过（FT）的分数从AAL或SNA色谱包含2-4％deglycopeptides，而30-50％的肽在绑定的分数追回deglycopeptides。通常情况下，使用QSTAR精英，1000年至1300年肽将确定在“金融时报”的一小部分，和200-400肽将在绑定的分数确定。两个或多个不同的蔗糖deglycopeptides应遵守在FT分数和绑定的比例（见表1）两个或两个以上不同的乳铁蛋白deglycopeptides。
表1。
Discussion
该协议提供了一种快速分离鉴定糖肽在聚糖特有的方式方法。作为广泛的范围内，特别是在发展和发病机制的有机体，糖基化变化，这种技术可能会适用于解决一个问题的多种。特别是，我们正在使用的方法，选择性地丰富糖肽已作为第一步对生物标志物发现与癌症相关的抗原表位修改。
Acknowledgments
这项工作是由癌症的主动性，5U24CA126477 - 04的临床蛋白质组学技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human plasma | We make this in house | ||
| Human lactoferrin | Sigma-Aldrich | L0520 | Trypsin-digest before use |
| Yeast invertase | Sigma-Aldrich | I0408 | Trypsin-digest before use |
| Oass HLB SPE cartridges | Waters | WAT094225 | 1 cc volume |
| ZipTip pipet tips | Fisher Scientific | ZTC1 8M0 96 | Millipore, C18 for 10 ml pipette |
| Tris | Fisher Scientific | BP154-1 | 99% |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | 99% |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 96% |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | 98% |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 242853 | 99.7% |
| pH indicator paper | Fisher Scientific | M95903 | Range 0-14 |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | 99.9% |
| Formic acid | Pierce, Thermo Scientific | 28905 | 99% |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 14190-136 | Without calcium and magnesium |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | 99.5% |
| PNGase F | New England Biolabs | P0705L | Glycerol-free |
| Vacuum-filter flasks | Fisher Scientific | SCGVU05RE | 0.2 mm pores |
| POROS-AL beads | Applied Biosystems | 1-6028-02 | |
| Aleuria aurantia lectin | Vector Laboratories | L-1390 | |
| Sambucus nigra agglutinin | Vector Laboratories | L-1300 | |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296945 | 5.0 M solution |
References
- Keshishian, H. multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution. Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).
