Summary
Lectin-konjugierten POROS Perlen wurden für die HPLC eingesetzt. Glycopeptid-Normen diente als positive und negative Kontrollen. MARS-14 aufgebraucht wurde trypsinverdauten Humanplasma chromatographiert und Flow-Through-(FT) und gebundenen Fraktionen für ESI-LC-MS/MS Analysen gesammelt. Glykopeptide wurden in der gebundenen Fraktion angereichert, um FT verglichen.
Abstract
Glykane sind eine wichtige Klasse von post-translationale Modifikationen. In der Regel auf sezerniert und extrazelluläre Moleküle gefunden, Signal Glykanstrukturen den internen Status der Zelle. Glykane auf Tumorzellen neigen dazu, reichlich Sialinsäure und Fucose-Einheiten haben. Wir schlagen vor, dass diese Krebs-assoziierte glycan Varianten für Biomarker-Entwicklung bei der Diagnose einer Erkrankung im Frühstadium sollen ausgeschöpft werden. Dementsprechend haben wir ein Massenspektrometrie-basierter Workflow, der Chromatographie an Affinitätsmatrizes von Lektinen, Proteine, die spezifisch Glykanstrukturen binden gebildet beinhaltet. Die Lektine Sambucus nigra (SNA) und Aleuria aurantia (AAL), die Sialinsäure und Fucose binden, wurden jeweils kovalent an POROS Perlen (Applied Biosystems) gekoppelt und verpackt in PEEK Säulen für Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC). Kurz gesagt, wurde Plasma von den vierzehn am häufigsten vorkommenden Proteine mit Hilfe eines Multiple-Affinität-Entfernungs-System (; Agilent MARS-14) erschöpft. Abgereichertes Plasma wurde Trypsin-verdaut und in Flow-Through-und gebundenen Fraktionen von SNA oder AAL HPLC. Die Fraktionen wurden mit PNGaseF behandelt werden, um N-Glycane zu entfernen, und mit Hilfe der LC-MS/MS auf einem QStar Elite. Die Daten wurden mittels Mascot-Software. Das experimentelle Design inklusive positiven Kontrollen fucosylierte und sialylierte humanes Lactoferrin Glykopeptide-und Negativ-Kontrollen-high Mannose Glycopeptide aus Saccharomyces cerevisiae-, die verwendet wurden, um die Spezifität der Lectin erfassen zu überwachen. Key Features dieser Workflow sind die Reproduzierbarkeit von HPLC-Format, die positive Identifikation der erfassten und PNGaseF behandelten Glykopeptide aus ihren deamidierten Asn-Xxx-Ser/Thr Motive und Qualitätsbewertung mit Glykoprotein-Normen abgeleitet. Protokoll-Optimierung ebenfalls enthalten, um die geeignete Verhältnis von Ausgangsmaterial zur Spalte Kapazität, Ermittlung der effizienten Erfassung und Elutionspuffer, und die Überwachung der PNGaseF-Behandlung in voller Deglykosylierung zu gewährleisten. Zukünftige Richtungen gehören die Verwendung dieser Workflow-Massenspektrometrie-basierte Entdeckung Experimente an Plasma von Patientinnen mit Brustkrebs und Kontrollpersonen durchgeführt.
Protocol
1) Bereiten Lektin-konjugierten POROS Spalten
- Setzen Sie auf eine Maske, um gegen das Einatmen von Poros-AL Perlen im Schritt 1.1 schützen - 1,2. Wiegen Sie die gewünschte Menge POROS Perlen (100 mg beads/300 ul Endvolumen) und Transfer in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen.
- Wash-Kügelchen mit Zugabe von 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS). Pellet Beads durch Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 3 Minuten. Überstand entfernen und wiederholen Sie die Wäsche.
- Wiegen Sie die gewünschte Menge an konjugierten Lektin (1 bis 4 mg / 200 ul Perlen) und in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen. Add PBS zu einem 5 - 20 mg / ml Lösung. Reserve von 25 ul dieser Lösung.
- Übertragen Sie die verbleibenden Lektin-Lösung, die POROS Perlen. Add Natriumcyanoborhydrid zu einer Endkonzentration von 50 mM. Das Röhrchen wird auf einer Wippe und reagieren bei Raumtemperatur über Nacht. (Hinweis:. Natriumcyanoborhydrid ist giftig und muss in einem Abzug gehandhabt werden kontaminierte Abfälle müssen entsprechend entsorgt werden.)
- Pellet der POROS Perlen wie in Schritt 1.2. Überstand entfernen und speichern wie die post-Konjugation Lösung.
- Wash Beads mit 1 ml Quenching Buffer (1 M Tris-Cl, pH 7,4). Pellet Perlen wie in Schritt 1,2 und sicher Überstand verwerfen.
- Blockieren Sie die verbleibenden reaktiven Stellen auf der POROS Beads mit 1 ml Quenching Buffer. Add Natriumcyanoborhydrid zu einer Endkonzentration von 50 mM. Das Röhrchen wird auf einer Wippe und Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min.
- Pellet Perlen wie in Schritt 1,2 und Überstand verwerfen.
- Wash Perlen mit 1 mL 1 M NaCl. Pellet Perlen und Überstand verwerfen. Wiederholen Sie die vier Mal für insgesamt fünf Wäschen. Die Perlen sind nun bereit zu packen.
- Zur Bestimmung der Menge an Protein, konjugiert mit dem POROS Perlen wurde, führen Sie eine Proteinkonzentration Assay auf der Pre-und Post-konjugierten konjugierte Lektin-Lösungen. Der Unterschied in der Konzentration ist die Menge an Protein, konjugiert mit den Perlen wurde. Die Menge an Protein konjugiert pro Perle Volumen entspricht der Konzentration von Lektin auf der Perlenschnur. Ziel Lektin-Konzentrationen liegen zwischen 2 -20 mg / mL.
2) Verpackung das Lektin-konjugierten POROS Perlen in einen PEEK Spalte
- Montieren Sie die Verpackung (Beschreibung folgt) und unterstützen sie auf einem Metallring stand. Die Verpackung besteht aus, von unten nach oben, Druck Drossel, Endspalte Koppler 1, Fritte, Spalte (2 x 50 mm), Endspalte Koppler 2, Spalte Stecker, Endspalte Koppler 3, Spalte (4,5 x 50 mm), Endspalte Koppler 4 und Endstück. Die obere Spalte dient als Reservoir für das Verpackungsmaterial.
- Resuspendieren POROS Perlen in der gewünschten Volumen von Puffer A (10 mM Tris-Puffer, pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid, 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid). Wenn Verpackung eine Spalte (~ 200 ul Bettvolumen), in 400 ul Puffer A resuspendiert
- Transfer-konjugierten POROS Perlen in der oberen Spalte (Stausee). Add Buffer A in das Reservoir, bis der Puffer erreicht die Spitze der Säule. Sanft statt der Endarmatur auf den Kopf der Kolonne und versuchten, um Luftblasen in der Säule zu vermeiden. Schließen Sie das Endstück der oberen Spalte, um die HPLC-System.
- Packen Sie die Spalte durch fließende Puffer A durch das System. Beginnen Sie mit einer Flussrate von 0,5 mL / min. Erhöhen Sie die Durchflussmenge von 0,5 ml / min pro Minute, bis entweder 4 mL / min oder der maximale Druck (3000 psi) erreicht ist. Weiter mit der maximal möglichen Durchsatz, bis mindestens 35 ml Puffer A durch die Säule passiert haben.
- Schalten Sie die Pumpen und damit den Druck auf die Spalte auf <20 psi fallen.
- Sanft, zerlegen die Verpackungsanlage, von oben beginnend. Wenn das Ende Spalte Koppler 2 erreicht ist, sorgfältig zu entfernen. Einige verpackt Material sollte von der Spitze der Säule werden Extrudieren. Mit einer Rasierklinge oder ähnlichem scharfe Kante, wischen weg das Extrudieren Perlen, so dass ein Wulst Oberfläche, die sogar mit dem oberen Ende der Säule. Üben Sie keinen Druck auf die Perlen, während dies zu tun.
- Lösen Sie die gepackte Säule aus dem Ring zu stehen. Legen Sie eine neue Fritte in ein neues Ende Koppler und drehen Sie die gepackte Säule über, dies mit der Fritte / Ende Koppler auf dem offenen (ehemals top) Spalte Ende zu verbinden.
- Beschriften Sie die Spalte entsprechend. Es ist jetzt einsatzbereit. Bei Nichtgebrauch kann die Säule in PBS mit 0,02% Natriumazid bei 4 ° C gelagert werden für bis zu 6 Monaten.
3) Programm der HPLC-Methode
- Die Details der Programmierung Ihrer HPLC wird nach den Besonderheiten der Software des Herstellers variieren. Wir verwenden eine Michrom Paradigm MG4 HPLC. Auf dieser Maschine werden Methoden gebaut und erreicht unter der Registerkarte "Setup" an der Spitze des Bildschirms. Programmieren Sie die folgende Methode:
Zeit Durchfluss (ul / min) % A % B 00.00 50 100 0 09.00 50 100 0 09.01 500 0 100 13.50 500 0 100 13.51 3000 100 0 19.50 3000 100 0
Puffer A: 10 mM Tris-Puffer, pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid, 10 mM Calciumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid
Puffer B: 0,5 M Essigsäure
Der UV-Detektor sollte so programmiert, dass bei 280 nm von 0.00 bis 19.50 Uhr gelesen werden. Die y-Achse sollte so eingestellt werden low-Absorption Ebenen, z. B. 0 erkannt werden -. 50 AU. - Wenn ein Autosampler zur Verfügung steht, Programm die folgenden Zeitplan für Fraktionssammlung. Ansonsten sammelt die Fraktionen von Hand wie bei der Durchführung von Chromatographie.
Bruchteil Verzögerung, die Sammlung aus Probenaufgabe Dauer der Erhebung (min) Durchfluss- 2,8 4,1 Gebunden 9 2,6
4) Bereiten Sie Proben für HPLC
- Vor diesem Protokoll verwenden, sollte Humanplasma der 14-reiche Proteine mit einem MARS Spalte (; Santa Clara, CA Agilent) aufgebraucht sein werden. Abgereichertes Plasma, Lactoferrin und Hefeinvertase sollte individuell sein trypsinverdauten und entsalzt wie zuvor 1 beschrieben.
- Zur Vorbereitung des Lektin-spezifischen Lactoferrin Standard, führen Chromatographie an 50 ug trypsinverdauten Lactoferrin entweder über die AAL oder die SNA Spalte mit der Methode in Teil 3. Die gebundene Fraktion enthält Lektin-spezifischen Lactoferrin Glykopeptide. Neutralisieren Sie die Proben wie in Teil 4.4 und entsalzen als in Teil 6. Resuspendieren der Probe in 1 ml Puffer A. Die resultierende Probe ist einsatzbereit.
- Drei experimentelle Wiederholungen durchgeführt. Zur Vorbereitung Probe für drei Wiederholungen, addiere 3 pmol trypsinverdauten Invertase und 1 ul Lektin-spezifischen Lactoferrin (entweder AAL-LAK oder SNA-LAC) auf 30 ul MARS-abgereicherten, trypsinverdauten, Plasma-Äquivalente (PE). Ein PE ist als das Volumen der non-processed/intact/original Plasma, aus dem eine bestimmte Menge an verarbeiteten Plasmas (MARS-abgereicherte und Trypsin) abgeleitet wurde, definiert. Add Buffer A auf die Probe auf ein Endvolumen von 330 ul zu erreichen.
- Add Neutralisationspuffer (1 M Tris pH 8,0), um die Probengefäße, dass Eluat sammeln. Die Anzahl und das Volumen der Vials mit denen Sie arbeiten werden, auf die Zwänge der Autosampler ab. Für die Paradigm MG4, sammelt ein Fläschchen der Flow-Through-und zwei sammeln das Eluat. Es erfordert etwa 1,5 mL Tris-Puffer auf 1 ml des Eluats zu neutralisieren. Ziel neutralisiert pH-Wert 7,0-8,0; test test endgültige pH-Wert mit pH-Indikatorpapier.
5) Führen Sie Chromatographie
- Alle Leerwert und Probe läuft, die folgen wird die Methode in Teil 1 beschrieben. Die Säule und Puffer sind bei Raumtemperatur während der Benutzung. Die Spalten werden bei 4 ° C gelagert, während Puffer bei Raumtemperatur gelagert werden.
- Bringen Sie entweder die AAL oder die SNA Lektinsäule der HPLC-System und führen Sie zwei leere Methoden (Injektion nur Buffer A). Stellen Sie sicher, dass das Lektin Säule an das Lektin-spezifischen Lactoferrin (Teil 2) entspricht.
- Chromatograph den drei Plasma-Proben, Einspritzen einer leeren zwischen den einzelnen injizierten Probe, für insgesamt 7 HPLC-Läufen. Fraktionen aus blank läuft brauchen nicht erhoben.
6) Desalt Fraktionen gesammelt
Für jede Fraktion verwenden Sie eine 1 mL Waters Oasis HLB SPE-Kartusche wie folgt:
- Bringen Sie die Anzahl der benötigten Kassetten Vakuumkammer.
- Wet jede Patrone mit 1 mL 80% ACN in 1% Ameisensäure (Vakuum-Messgerät auf vielfältige sollte 5 gelesen - 20 lnHg).
- Äquilibrieren Patronen mit 1,5 ml 0,1% Ameisensäure (Vakuum-Messgerät auf vielfältige sollte 5 gelesen - 20 lnHg)
- Laden gesamte Volumen einer Probe auf eine Patrone (Vakuum-Messgerät auf vielfältige sollte 2 gelesen -. 2,5 lnHg und Durchfluss sollte nicht mehr als 1 ml / min)
- Wash-Kartuschen mit 3 x 1 mL 0,1% Ameisensäure (Vakuum-Messgerät auf vielfältige sollte 5 gelesen - 20 lnHg)
- Eluieren Peptide / Glykopeptide in beschriftete Eppendorf-Röhrchen mit 1 x 1 mL 80% Acetonitril in 0,1% iger Ameisensäure. (Vakuum-Messgerät auf vielfältige lesen sollten 2 bis 2,5 lnHg und Durchfluss sollte nicht mehr als 1 ml / min.) Ein einzelnes Sammelröhrchen für jede Patrone verwendet werden sollte.
- Neutralisieren Eluat durch Zugabe von 60 ul 0,5 M Ammoniumhydrogencarbonat jedem Sammelrohr. Ziel neutr.funktionalisierten pH-Wert ist 7,0-8,0; Test End-pH mit pH-Indikatorpapier.
- Konzentrieren Sie sich eluierten Peptide / Glykopeptide auf ~ 50 ul, indem Sie sie auf einer Vakuum-Zentrifuge (z. B. eine Thermo Savant SpeedVac) für ca. 2 Stunden bei 35 ° C.
7) PNGase F-Verdauung
- Prüfling pH zu gewährleisten ist zwischen 7,0 bis 8,0. Wenn nötig, fügen Sie 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat pH zu erhöhen. Wenn die endgültige Probenvolumen> 100 ul, Speedvac Probe, bis es zwischen 50-100 ul ist.
- Add 0,5 ul (250 U) Glycerin-free PNGase F zu jeder Probe Rohr und bei 37 ° C über Nacht.
8) Zip Tip Proben
- Beginnend mit PNGase F-verdauten Proben, ZipTip jeweils wie folgt.
- Wet ZipTip mit 10 ul 100% Acetonitril, gefolgt von 10 ul 80% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure.
- Äquilibrieren ZipTip mit 20 ul 0,1% Ameisensäure.
- Legen Sie die Probe auf die ZipTip durch Pipettieren es rauf und runter durch die ZipTip Matrix 10-mal.
- Waschen Sie die ZipTip durch Pipettieren 10 pl 0,1% Ameisensäure, 5-mal.
- Eluieren der Probe in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen mit 10 ul 80% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure.
- Wiederholen Sie die Elution und fügen Sie den zweiten 10 ul in das gleiche Rohr.
- Speedvac die Proben auf ein Volumen von <2 pl.
- Resuspendieren Proben in 20 ul 0,1% Ameisensäure. Die Proben sind nun bereit für die Analyse durch LC-MS/MS.
9) repräsentative Ergebnisse:
Die POROS Konjugation typischerweise Erträge On-Bead-Lektin-Konzentrationen im Bereich von 2 bis 20 mg / mL. Dies ist optimal für die Affinitätschromatographie.
Lektinchromatographie von trypsinverdauten MARS-abgereicherten Humanplasma in der Regel eine Bereicherung Glykopeptide in der gebundenen Fraktion. Wie sind die Glykopeptide PNGase F-behandelten vor LC-MS/MS, werden sie als Peptide mit der N-linked Konsensussequenz identifiziert, NXS / T (X steht für alle Rückstände, aber Prolin), in denen die Asparagin zu umgewandelt wurde einer Asparaginsäure durch die Einwirkung von PNGase F. Peptide mit diesen Eigenschaften werden als deglykosylierter Peptide (oder "deglycopeptides") werden. Im Durchschnitt der Flow-Through-(FT)-Fraktion aus AAL oder SNA-Chromatographie enthält 2-4% deglycopeptides, während 30-50% der Peptide in der gebundenen Fraktion gewonnen deglycopeptides sind. In der Regel mit einem QStar Elite, wird 1000-1300 Peptide in der FT-Fraktion identifiziert werden, und 200-400 Peptide werden in der gebundenen Fraktion identifiziert werden. Zwei oder mehr verschiedene Invertase deglycopeptides sollte in der FT-Fraktion und zwei oder mehr unterschiedliche Lactoferrin deglycopeptides in der gebundenen Fraktion (Tabelle 1) eingehalten werden.
Tabelle 1.
Discussion
Dieses Protokoll bietet eine schnelle Methode zur Isolierung und Identifizierung von Glycopeptiden in ein Glykan-spezifische Art und Weise. Als Glykosylierung variiert weitgehend innerhalb eines Organismus, insbesondere bei der Entwicklung und Pathogenese, kann diese Technik anzuwenden, um eine Vielzahl von Fragen zu beantworten. Insbesondere sind wir mit der Methode zur selektiven Anreicherung Glykopeptide, die mit Krebs-assoziierte Epitope wurden als erster Schritt in Richtung Entdeckung neuer Biomarker geändert.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Clinical Proteomics Technologies for Cancer Initiative 5U24CA126477-04 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human plasma | We make this in house | ||
| Human lactoferrin | Sigma-Aldrich | L0520 | Trypsin-digest before use |
| Yeast invertase | Sigma-Aldrich | I0408 | Trypsin-digest before use |
| Oass HLB SPE cartridges | Waters | WAT094225 | 1 cc volume |
| ZipTip pipet tips | Fisher Scientific | ZTC1 8M0 96 | Millipore, C18 for 10 ml pipette |
| Tris | Fisher Scientific | BP154-1 | 99% |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | 99% |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 96% |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | 98% |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 242853 | 99.7% |
| pH indicator paper | Fisher Scientific | M95903 | Range 0-14 |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | 99.9% |
| Formic acid | Pierce, Thermo Scientific | 28905 | 99% |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 14190-136 | Without calcium and magnesium |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | 99.5% |
| PNGase F | New England Biolabs | P0705L | Glycerol-free |
| Vacuum-filter flasks | Fisher Scientific | SCGVU05RE | 0.2 mm pores |
| POROS-AL beads | Applied Biosystems | 1-6028-02 | |
| Aleuria aurantia lectin | Vector Laboratories | L-1390 | |
| Sambucus nigra agglutinin | Vector Laboratories | L-1300 | |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296945 | 5.0 M solution |
References
- Keshishian, H. multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution. Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).
