Een Lectin HPLC-methode voor het selectief-geglycosyleerde Peptiden Enrich van complexe biologische monsters

Summary

Lectine-geconjugeerde POROS kralen werden gebruikt voor HPLC. Glycopeptide normen dienden als positieve en negatieve controles. MARS-14 leeg is, werd trypsine-verteerd menselijk plasma gechromatografeerd en flow-through (FT) en gebonden fracties verzameld voor ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptiden werden verrijkt in de gebonden fractie ten opzichte van FT.

Abstract

Glycanen zijn een belangrijke klasse van post-translationele modificaties. Meestal te vinden op uitgescheiden en extracellulaire moleculen, structuren glycaan het signaal van de interne status van de cel. Glycanen op tumorcellen hebben de neiging om overvloedige siaalzuur en fucose groepen hebben. Wij stellen dat deze kanker-geassocieerde glycan varianten worden benut voor biomarker ontwikkeling gericht op de diagnose van een vroeg stadium van de ziekte. Daarom ontwikkelden we een massaspectrometrie-gebaseerde workflow die affiniteit chromatografie op matrices gevormd uit lectines, eiwitten die specifieke glycaan structuren te binden opgenomen. De lectinen Sambucus nigra (SNA) en Aleuria aurantia (AAL), dat siaalzuur en fucose binden, respectievelijk, werden covalent gekoppeld aan POROS kralen (Applied Biosystems) en verpakt in PEEK kolommen voor hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC). In het kort werd plasma uitgeput van de veertien meest voorkomende eiwitten met behulp van een multiple affiniteit verwijdering van het systeem (MARS-14; Agilent). Verarmd plasma werd trypsine-verteerd en gescheiden in doorstroming en gebonden fracties door SNA of AAL HPLC. De fracties werden behandeld met PNGaseF naar N-gekoppelde glycanen te verwijderen, en geanalyseerd door LC-MS/MS op een QStar Elite. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van Mascot software. Het experimentele ontwerp opgenomen positieve controles-gefucosyleerde en sialylated humaan lactoferrine glycopeptiden-en negatieve controles hoog mannose glycopeptiden van Saccharomyces cerevisiae-die werden gebruikt om de specificiteit van lectine vast te leggen te controleren. Belangrijkste kenmerken van deze workflow zijn de reproduceerbaarheid afgeleid van de HPLC-formaat, de positieve identificatie van de gevangen genomen en PNGaseF behandeld glycopeptiden van hun gedeamideerde Asn-Xxx-Ser/Thr motieven, en de kwaliteit beoordelen met behulp van glycoproteïne normen. Protocol optimalisatie ook het bepalen van de juiste verhouding van uitgangsmateriaal tot en met kolom capaciteit, het identificeren van de meest efficiënte afvang en elutiebuffers, en het toezicht op de PNGaseF-behandeling om volledige deglycosylatie te verzekeren. Toekomstige richtingen omvatten het gebruik van deze workflow aan massaspectrometrie-gebaseerde ontdekking van experimenten uit te voeren op plasma van borstkanker patiënten en controle individuen.

Protocol

1) Bereid lectine-geconjugeerd POROS columns

1. Zet een masker tegen de inademing van POROS-AL kralen te beschermen tijdens het stappen 1,1 tot 1,2. Weeg de gewenste hoeveelheid POROS kralen (100 mg beads/300 ul uiteindelijk volume) en overbrengen in een schone eppendorfbuisje.
2. Was kralen met toevoeging van 1 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Pellet kralen door centrifugeren in een microcentrifuge op maximale snelheid voor 3 minuten. Verwijder supernatant en herhaal de wassen.
3. Weeg de gewenste hoeveelheid van ongeconjugeerde lectine (1 - 4 mg / 200 pi kralen) en over te dragen aan een schoon eppendorfbuisje. Voeg PBS om een ​​5 formulier - 20 mg / ml oplossing. Reserve 25 ul van deze oplossing.
4. Breng de resterende lectine oplossing voor de POROS kralen. Voeg natriumcyaanboorhydride tot een uiteindelijke concentratie van 50 mM. Plaats de buis op een rocker en reageren 's nachts bij kamertemperatuur. (Let op:. Natriumcyaanboorhydride is giftig en moet behandeld in een zuurkast worden Besmet afval moet worden afgevoerd.)
5. Pellet de POROS parels zoals in stap 1.2. Verwijder supernatant en opslaan als de post-conjugatie oplossing.
6. Was kralen met een mL Afschrikken Buffer (1 M Tris-Cl, pH 7,4). Pellet parels zoals in stap 1.2 en veilig te ontdoen van supernatant.
7. Blokkeer de resterende reactieve plaatsen op het POROS kralen met 1 mL Afschrikken Buffer. Voeg natriumcyaanboorhydride tot een uiteindelijke concentratie van 50 mM. Plaats de buis op een rocker en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
8. Pellet parels zoals in stap 1.2 en gooi supernatant.
9. Was kralen met 1 mL 1 M NaCl. Pellet kralen en gooi supernatant. Herhaal dit vier keer voor een totaal van vijf wasbeurten. De kralen zijn nu klaar om in te pakken.
10. Voor het bepalen van de hoeveelheid eiwit dat was geconjugeerd aan de POROS kralen, voert u een eiwitconcentratie test op de pre-en post-geconjugeerde geconjugeerd lectine oplossingen. Het verschil in concentratie is de hoeveelheid eiwit dat was geconjugeerd aan de kralen. De hoeveelheid eiwit geconjugeerde per kraal volume is gelijk aan de concentratie van lectine op de kralen. Target lectine concentraties tussen twee 20 mg / ml.

2) Verpakken van de lectine-geconjugeerde POROS kralen in een kolom PEEK

1. Monteer de verpakking systeem (beschrijving volgt) en de ondersteuning van het op een metalen ring staan. De verpakking bestaat uit, van onder naar boven, druk restrictor, eind kolom koppeling 1, frit, kolom (2 x 50 mm), einde kolom koppeling 2, kolom connector, end kolom koppelstuk 3, kolom (4,5 x 50 mm), end kolom koppeling 4 en eindstuk. De bovenste kolom dient als reservoir voor het verpakkingsmateriaal.
2. Resuspendeer de POROS kralen in de gewenste volume van de buffer A (10 mM Tris-buffer, pH 7,4, 150 mM natriumchloride, 10 mM calciumchloride, 10 mM magnesiumchloride). Als verpakking een kolom (~ 200 pi bed volume), opnieuw in suspensie in 400 ul buffer A.
3. Overdracht geconjugeerde POROS kralen in de bovenste kolom (reservoir). Voeg Buffer A om het reservoir totdat de buffer bereikt de top van de kolom. Plaats voorzichtig het eindstuk op de bovenkant van de kolom, in een poging om luchtbellen te voorkomen in de kolom. Sluit het eindstuk van de bovenste kolom met de HPLC-systeem.
4. Verpak de kolom door stroomt Buffer A tot en met het systeem. Begin met een debiet van 0,5 ml / min. Verhoog het debiet van 0,5 ml / min iedere minuut totdat hetzij 4 ml / min of de maximale druk (3000 psi) is bereikt. Ga verder op de maximaal mogelijke debiet tot ten minste 35 ml buffer A zijn gepasseerd door de kolom.
5. Schakel de pompen en laat de druk op de kolom te laten dalen tot <20 psi.
6. Voorzichtig, te demonteren de verpakking, te beginnen vanaf de top. Als het einde kolom koppeling 2 wordt bereikt, voorzichtig te verwijderen. Sommige verpakt materiaal moet worden extruderen van de top van de kolom. Met een scheermesje of een soortgelijke scherpe rand, veeg voorzichtig het extruderen kralen, waardoor een kraal oppervlak dat zelfs met de bovenkant van de kolom. Oefen geen druk uit op de kralen terwijl je dit doet.
7. Maak de gepakte kolom van de ring staan. Plaats een nieuwe frit in een nieuw einde koppeling en draai de gepakte kolom naar dit verbinden met de frit / einde koppeling op de open (voorheen boven) kolom eindigen.
8. Passend etiket van de kolom. Het is nu klaar voor gebruik. Wanneer niet in gebruik is, kan de kolom worden opgeslagen in PBS met 0,02% natriumazide bij 4 ° C gedurende maximaal 6 maanden.

3) Programmeer de HPLC-methode

1. De details van het programmeren van uw HPLC is afhankelijk van de specifieke kenmerken van de software van de fabrikant. We maken gebruik van een Michrom Paradigm MG4 HPLC. Op deze machine, worden methoden gebouwd en geopend onder het "Setup" tab aan de bovenkant van het scherm. Programma de volgende methode:
   

   Tijd	Debiet (pl / min)	% A	% B
   00:00	50	100	0
   09:00	50	100	0
   09:01	500	0	100
   13:50	500	0	100
   13:51	3000	100	0
   19:50	3000	100	0

   
   Buffer A: 10 mM Tris-buffer, pH 7,4, 150 mM natriumchloride, 10 mM calciumchloride, 10 mM magnesiumchloride
   Buffer B: 0,5 M azijnzuur
   De UV-detector moet worden geprogrammeerd bij 280 nm lezen van 00:00 tot 19:50. De y-as moet worden aangepast aan de lage absorptie niveaus, bijvoorbeeld, 0 te sporen. - 50 AU.
2. Als een autosampler beschikbaar is, het programma de volgende schema voor fractie collectie. Anders, verzamel de fracties met de hand, zoals aangegeven bij het uitvoeren van chromatografie.
   

   Fractie	Vertraging voor collectie van monsterinjectie	Duur van de collectie (min)
   Flow-through	2.8	4.1
   Gebonden	9	2.6

4) Bereid monsters voor HPLC

1. Voorafgaand aan het gebruik in dit protocol, moet het menselijk plasma worden uitgeput van de 14 meest voorkomende eiwitten met behulp van een MARS kolom (Agilent, Santa Clara, CA). Verarmd plasma, humaan lactoferrine en gist invertase dient individueel te worden trypsine-verteerd en ontzout zoals eerder ^{beschreven: 1.}
2. Ter voorbereiding van de lectine-specifieke lactoferrine standaard, uit te voeren chromatografie op 50 ug trypsine-verteerd lactoferrine op ofwel de AAL of de SNA kolom met behulp van de methode in deel 3. De gebonden fractie bevat lectine-specifieke lactoferrine glycopeptiden. Neutraliseer de monsters zoals in deel 4.4, en ontzouten als in deel 6. Resuspendeer het monster in 1 ml buffer A. De resulterende monster is klaar voor gebruik.
3. Drie experimentele repliceert zal worden uitgevoerd. Ter voorbereiding steekproef voor drie duplo, voeg 3 pmol van trypsine-verteerd invertase en 1 ul van lectine-specifieke lactoferrine (hetzij AAL-LAC of SNA-LAC) op 30 ul MARS-leeg is, trypsine-verteerd, plasma-equivalenten (PE). Een PE is gedefinieerd als het volume van de non-processed/intact/original plasma, waaruit een bepaalde hoeveelheid verwerkte plasma (MARS-verarmd en trypsine verteerd) werd afgeleid. Voeg Buffer A om het monster tot een eindvolume van 330 ul te bereiken.
4. Voeg neutralisatie buffer (1 M Tris pH 8,0), de sample flesjes die zal verzamelen eluaat. Het aantal en volume van de flacons waarmee u werkt zal afhangen van de beperkingen van uw autosampler. Voor de Paradigm MG4, een flacon verzamelt de doorstroming en twee verzamel het eluaat. Het is ongeveer 1,5 ml Tris-buffer aan 1 ml eluaat te neutraliseren. Target geneutraliseerd pH is 7,0-8,0; test test uiteindelijke pH met een pH-indicator papier.

5) Voer de chromatografie

1. Alle blanco en monster loopt die volgen zal gebruik maken van de methode beschreven in deel 1. De kolom en buffers op kamertemperatuur zijn tijdens het gebruik. Kolommen worden bewaard bij 4 ° C, terwijl de buffers worden bewaard bij kamertemperatuur.
2. Bevestig ofwel de AAL of het SNA lectine kolom met de HPLC-systeem en voer twee blanco methodes (het injecteren van alleen Buffer A). Zorg ervoor dat het lectine kolom komt overeen met het lectine-specifieke lactoferrine (deel 2).
3. Gaschromatograaf de drie plasma-monsters, het injecteren van een blanco tussen elke geïnjecteerd monster, voor een totaal van 7 HPLC loopt. Fracties van blank loopt niet te worden verzameld.

6) ontzouten ingezamelde fracties

Voor elke fractie gebruik maken van een 1 mL Waters Oasis HLB SPE cartridge als volgt:

1. Bevestig het aantal benodigde cartridges voor vacuum spruitstuk.
2. Nat elke cartridge met 1 ml 80% ACN in 1% mierezuur (vacuümmeter op manifold moeten lezen 5-20 lnHg).
3. Evenwicht cartridges met 1,5 ml 0,1% mierezuur (vacuümmeter op manifold moeten lezen 5-20 lnHg)
4. Belasting gehele volume van een monster op een cartridge (Vacuümmeter op spruitstuk moeten lezen 2 -. 2,5 lnHg, en het debiet mag niet meer dan 1 ml / min)
5. Was cartridges met 3 x 1 ml 0,1% mierezuur (Vacuümmeter op spruitstuk moeten lezen 5-20 lnHg)
6. Elueer peptiden / glycopeptiden in gelabelde Eppendorf buisjes met 1 x 1 ml 80% acetonitril in 0,1% mierenzuur. (Vacuümmeter op spruitstuk moeten lezen 2 tot 2,5 lnHg, en het debiet mag niet meer dan 1 ml / min.) Een enkele collectie buis moet worden gebruikt voor elke cartridge.
7. Neutraliseren eluaat door het toevoegen van 60 pi 0,5 M ammoniumbicarbonaat aan elke collectie buis. Target neutralized pH-waarde is, is 7,0-8,0; testen uiteindelijke pH met een pH-indicator papier.
8. Concentreer geëlueerd peptiden / glycopeptiden tot ~ 50 uL door ze op een vacuüm centrifuge (bijvoorbeeld een Thermo Savant SpeedVac) voor ~ 2 uur @ 35 ° C.

7) PNGase F-vergisting

1. Monster pH te zijn dat de tussen de 7,0 tot 8,0. Indien nodig, voeg 50 mM ammoniumbicarbonaat om de pH te verhogen. Als eindmonster volume is> 100 pl, speedvac monster zo tussen 50-100 pl.
2. Voeg 0,5 pl (250 U) glycerol-vrij PNGase F aan elk monster buisje en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht.

8) Zip Tip monsters

1. Te beginnen met PNGase F-verteerde monsters, ZipTip ieder als volgt.
2. Nat ZipTip met 10 ul 100% acetonitril, gevolgd door 10 pi 80% acetonitril, 0,1% mierenzuur.
3. Evenwicht ZipTip met 20 ul 0,1% mierenzuur.
4. Laad het monster op de ZipTip door pipetteren op en neer door de ZipTip matrix 10 keer.
5. Was de ZipTip door pipetteren 10 pi 0,1% mierenzuur, 5 keer.
6. Elueer het monster in een schone eppendorfbuisje met 10 ul 80% acetonitril, 0,1% mierenzuur.
7. Herhaal de elutie en voeg de tweede 10 pi in dezelfde buis.
8. Speedvac de monsters tot een volume van <2 pi.
9. Resuspendeer monsters in 20 ui 0,1% mierenzuur. Monsters zijn nu klaar voor analyse door LC-MS/MS.

9) representatieve resultaten:

De POROS vervoeging levert meestal op-kraal lectine concentraties in de range van 2 - 20 mg / ml. Dit is optimaal voor affiniteitschromatografie.

Lectine chromatografie van trypsine-verteerd MARS-uitgeput menselijk plasma verrijkt meestal glycopeptiden in de gebonden fractie. Omdat de glycopeptiden zijn PNGase voorafgaand aan de LC-MS/MS F-behandeld, worden ze aangeduid als peptiden met de N-gekoppelde consensus sequentie, NXS / T (waarbij X een residu, maar proline), waarin de asparagine is omgebouwd tot een asparaginezuur door de werking van PNGase F. peptiden met deze kenmerken worden beschouwd deglycosylated peptiden (of "deglycopeptides"). Gemiddeld de doorstroom (FT) fractie van AAL-of SNA chromatografie bevat 2-4% deglycopeptides, terwijl 30-50% van de peptiden teruggevonden in de gebonden fractie zijn deglycopeptides. Typisch, met behulp van een QStar Elite, zal 1000-1300 peptiden worden geïdentificeerd in de FT fractie, en 200-400 peptiden zullen worden geïdentificeerd in de gebonden fractie. Twee of meer afzonderlijke Invertase deglycopeptides moet worden waargenomen in de FT fractie en twee of meer verschillende lactoferrine deglycopeptides in de gebonden fractie (tabel 1).

Tabel 1.

Discussion

Dit protocol biedt een snelle methode voor het isoleren en het identificeren van glycopeptiden in een glycan-specifieke wijze. Zoals glycosylering varieert uitvoerig binnen een organisme, in het bijzonder tijdens de ontwikkeling en pathogenese, kan deze techniek worden toegepast op een breed scala van vraagstukken aan te pakken. In het bijzonder zijn we met behulp van de methode om selectief te verrijken glycopeptiden die zijn met kanker-geassocieerde epitopen gewijzigd als een eerste stap op weg naar de ontdekking van biomarkers.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human plasma			We make this in house
Human lactoferrin	Sigma-Aldrich	L0520	Trypsin-digest before use
Yeast invertase	Sigma-Aldrich	I0408	Trypsin-digest before use
Oass HLB SPE cartridges	Waters	WAT094225	1 cc volume
ZipTip pipet tips	Fisher Scientific	ZTC1 8M0 96	Millipore, C18 for 10 ml pipette
Tris	Fisher Scientific	BP154-1	99%
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	A6141	99%
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901	96%
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	98%
Acetic acid	Sigma-Aldrich	242853	99.7%
pH indicator paper	Fisher Scientific	M95903	Range 0-14
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998	99.9%
Formic acid	Pierce, Thermo Scientific	28905	99%
Phosphate-buffered saline	Invitrogen	14190-136	Without calcium and magnesium
Sodium azide	Sigma-Aldrich	71289	99.5%
PNGase F	New England Biolabs	P0705L	Glycerol-free
Vacuum-filter flasks	Fisher Scientific	SCGVU05RE	0.2 mm pores
POROS-AL beads	Applied Biosystems	1-6028-02
Aleuria aurantia lectin	Vector Laboratories	L-1390
Sambucus nigra agglutinin	Vector Laboratories	L-1300
Sodium cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	296945	5.0 M solution