Summary
Lektin-konjugerade POROS pärlor var anställda för HPLC. Glykopeptid standarder varit positiva och negativa kontroller. MARS-14 utarmat var trypsin-rötas humanplasma kromatograferas och genomströmning (FT) och bundna fraktioner samlas in för ESI-LC-MS/MS analyser. Glykopeptider berikades i bundna fraktionen jämfört med FT.
Abstract
Glycans är en viktig klass av post-translationella modifieringar. Som normalt återfinns på utsöndras och extracellulära molekyler, glycan strukturer signalera interna ställning cellen. Glycans på tumörceller tenderar att ha rikligt med sialinsyra och beståndsdelarna fukos. Vi föreslår att dessa cancer-associerade glycan varianter utnyttjas för biomarkör utveckling som syftar till att diagnostisera tidigt skede av sjukdomen. Därför utvecklade vi en masspektrometri-baserad arbetsflöde som innehåller kromatografi på samhörighet matriser som bildas av lektiner, proteiner som binder specifikt glycan strukturer. Den lektiner Sambucus nigra (SNA) och Aleuria aurantia (AAL), som binder sialinsyra och fukos, respektive var kovalent kopplade till Poros pärlor (Applied Biosystems) och packas i PEEK kolumner för högt tryck vätskekromatografi (HPLC). Kort sagt, var plasma utarmat av de fjorton mest förekommande proteiner med hjälp av en multipel systemet affinitet borttagning (Mars-14, Agilent). Utarmat plasma trypsin-smälts och separeras i genomströmning och bundna fraktioner av SNA eller AAL HPLC. De procenttal som behandlades med PNGaseF att ta bort N-bundna glykaner, och analyseras av LC-MS/MS på en QStar Elite. Data analyserades med hjälp av Mascot programvara. Den experimentella designen ingår positiva kontroller-fucosylated och sialylated mänskligt laktoferrin glykopeptider-och negativa kontroller hög mannos glykopeptider från Saccharomyces cerevisiae, som användes för att övervaka specificitet lektin fånga. Viktiga funktioner i arbetsflödet omfattar reproducerbarhet härleds från HPLC-format, en positiv identifiering av de tagna och PNGaseF behandlade glykopeptider från sina deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motiv och kvalitetsbedömning med glykoprotein standarder. Protokoll optimering ingår också att fastställa lämplig andel av utgångsmaterial till kolumn kapacitet att identifiera de mest effektiva fånga och buffertar eluering och övervakning av PNGaseF-behandling för att säkerställa full deglycosylation. Framtida inriktningar inkluderar användning detta arbetsflöde för att utföra masspektrometri-baserad upptäckt experiment på plasma från patienter bröstcancer och individer kontroll.
Protocol
1) Förbered lektin-konjugerat POROS kolumner
- Sätt på dig en mask för att skydda mot inandning Poros-AL pärlor under steg 1.1 - 1.2. Väg upp önskad mängd Poros pärlor (100 mg beads/300 l slutlig volym) och överför till ett rent Eppendorf-rör.
- Tvätta pärlor med tillsats av 1 ml buffrad fosfat-saltlösning (PBS). Pellets pärlor genom centrifugering i en mikrocentrifug med maximal hastighet i 3 minuter. Avlägsna supernatanten och upprepa tvätt.
- Väg upp önskad mängd okonjugerat lektin (1 - 4 mg / 200 l pärlor) och överför till ett rent Eppendorf-rör. Lägg PBS för att bilda en 5 - 20 mg / ml. Reserv 25 ìl av denna lösning.
- Överföra den återstående lektin lösningen på POROS pärlor. Lägg natrium cyanoborohydride till en slutlig koncentration på 50 mm. Placera röret på en rocker och reagera över natten i rumstemperatur. (Obs:. Natrium cyanoborohydride är giftigt och måste hanteras i dragskåp Kontaminerat avfall måste tas om hand på lämpligt sätt.)
- Pelletera POROS pärlor som i steg 1,2. Avlägsna supernatanten och spara som efter konjugering lösning.
- Tvätta pärlor med 1 ml Släckning buffert (1 M Tris-Cl, pH 7,4). Pellets pärlor som i steg 1,2 och säkert kassera supernatanten.
- Blockera resterande reaktiva platser på POROS pärlor med 1 ml Släckning buffert. Lägg natrium cyanoborohydride till en slutlig koncentration på 50 mm. Placera röret på en rocker och inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
- Pellets pärlor som i steg 1.2 och kassera supernatanten.
- Tvätta pärlor med 1 ml 1 M NaCl. Pellets pärlor och kassera supernatanten. Upprepa fyra gånger för totalt fem tvättar. Kulorna är nu redo att packa.
- För att bestämma mängden protein som konjugerats till POROS pärlor, göra en analys proteinkoncentration på pre-konjugerat och efter konjugerade lektin lösningar. Skillnaden i koncentration är mängden protein som konjugerad med kulorna. Mängden protein konjugerat per pärla volym motsvarar koncentrationen av lektin på pärlor. Mål lektin koncentrationerna ligger mellan 2 -20 mg / ml.
2) Packa lektin-konjugerade POROS pärlor i en PEEK kolumn
- Montera packning (beskrivning följer) och stödja det på en metallring stativ. Förpackning består av, från botten till toppen, tryck strypning, avsluta kolumn 1 koppel, glasmassa, kolumn (2 x 50 mm), slutet kolumn koppel 2, kolumn kontakt, slutet kolumn koppel 3, kolumn (4,5 x 50 mm), slutet kolumn koppel 4 och slut montering. Den övre kolonnen fungerar som en reservoar för förpackningsmaterial.
- Resuspendera POROS pärlor i önskad volym av buffert A (10 mM Tris-buffert, pH 7,4, 150 mm natriumklorid, 10 mm kalciumklorid, 10 mM magnesiumklorid). Om packning en kolumn (~ 200 l sängen volym), återsuspendera i 400 l buffert A.
- Överför konjugerade POROS pärlor i den övre kolonnen (reservoar). Lägg Buffert A till reservoaren tills bufferten når toppen av kolumnen. Placera försiktigt änden monteras på toppen av kolumnen, försöker undvika luftbubblor i kolumnen. Anslut änden montering av den övre kolumnen till HPLC-systemet.
- Packa kolonnen med flödande buffert A genom systemet. Börja med ett flöde på 0,5 ml / min. Öka flödet med 0,5 ml / min varje minut tills antingen 4 ml / min eller maximalt tryck (3000 psi) har nåtts. Fortsätt i högsta möjliga flöde förrän minst 35 ml buffert A har passerat genom kolonnen.
- Stäng av pumparna och låta trycket på kolumnen för att sjunka till <20 psi.
- Försiktigt isär förpackning systemet, med början från toppen. När slutet kolumnen kopplingen 2 nås bort noggrant. Vissa packat material bör strängpressning från toppen av kolumnen. Med ett rakblad eller liknande vass kant, försiktigt torka bort strängpressning pärlor, lämnar en pärla yta som är jämn med toppen av kolumnen. Tryck inte på kulorna medan du gör detta.
- Koppla den packade kolonnen från ringen står. Placera en ny glasmassa till en ny slut koppel och vrid den packade kolonnen över att ansluta detta med fritta / avsluta koppel på den öppna (tidigare överst) spalt slut.
- Märk kolumnen lämpligt sätt. Det är nu klart för användning. När den inte används, kan den kolumn lagras i PBS med 0,02% natriumazid vid 4 ° C i upp till sex månader.
3) Program HPLC-metoden
- Detaljerna i Programmering HPLC varierar beroende på detaljerna i tillverkarens programvara. Vi använder en Michrom Paradigm MG4 HPLC. På denna maskin, är metoder byggs och öppnas under "Inställningar"-fliken längst upp på skärmen. Programmera följande metod:
Tid Flöde (l / min) % A % B 00:00 50 100 0 09:00 50 100 0 09:01 500 0 100 13:50 500 0 100 13:51 3000 100 0 19:50 3000 100 0
Buffert A: 10 mM Tris-buffert, pH 7,4, 150 mm natriumklorid, 10 mm kalciumklorid, 10 klorid mM magnesium
Buffert B: 0,5 M ättiksyra
Den UV-detektor bör programmeras att läsa vid 280 nm från 0:00 till 19:50. Y-axeln bör justeras för att upptäcka låg absorbans nivåer, t.ex. 0 -. 50 AU. - Om ett autosampler är tillgänglig programmet följande schema för fraktionen samling. Annars samla fraktioner hand enligt när de utför kromatografi.
Bråk Fördröjning till samlingen från prov injektion Varaktighet för insamling (min) Genomströmning 2,8 4,1 Bound 9 2,6
4) Förbered prover för HPLC
- Före användning i detta protokoll bör humanplasma vara uttömda av de 14 mest förekommande proteiner med hjälp av en MARS kolumn (Agilent, Santa Clara, CA). Utarmat plasma, mänskligt laktoferrin och jäst invertas ska vara individuellt trypsin-smälts och desalted som tidigare beskrivits 1.
- För att förbereda lektin-specifika laktoferrin standard, utföra kromatografi på 50 ug trypsin-rötas laktoferrin över antingen AAL eller SNA kolumnen med metoden i del 3. Den bundna fraktionen kommer att innehålla lektin-specifika laktoferrin glykopeptider. Neutralisera prover i del 4,4, och AVSALTA i del 6. Resuspendera provet i en 1 ml buffert A. Den resulterande provet är klar för användning.
- Tre experimentella replikat kommer att utföras. För att förbereda provet för tre replikat, tillsätt 3 pmol av trypsin smält-invertas och en ìl lektin-specifika laktoferrin (antingen AAL-LAC eller SNA-LAC) till 30 l MARS-utfiskade, trypsin-smält, plasma ekvivalenter (PE). En PE definieras som volym av non-processed/intact/original plasma från vilken en given mängd bearbetad plasma (MARS-utarmat och trypsin smält) blev framtagen. Lägg Buffert A till provet för att nå en slutlig volym på 330 l.
- Lägg neutralisering buffert (1 M Tris pH 8,0), till provet injektionsflaskor som ska samla in eluatet. Antalet och volymen av flaskor du arbetar med beror på de begränsningar av din autosampler. För Paradigm MG4, samlar en injektionsflaska av genomströmning och två Samla upp eluatet. Det kommer att kräva ca 1,5 ml Tris-buffert för att neutralisera 1 ml eluat. Target neutraliseras pH är 7,0-8,0, test test slutligt pH med pH-indikator papper.
5) Utför kromatografi
- Alla de tomma och prov kör som följer kommer att använda den metod som beskrivs i del 1. Kolumnen och buffertar i rumstemperatur under användning. Kolumner lagras vid 4 ° C, medan buffertar förvaras i rumstemperatur.
- Fäst antingen AAL eller SNA lektin kolumnen till HPLC-systemet och kör två tomma metoder (som injicerat bara Buffer A). Se till att lektin kolumnen motsvarar den lektin-specifika laktoferrin (del 2).
- Kromatografens de tre plasmaproverna, injicera en tom mellan varje insprutning prov, för totalt 7 HPLC körningar. Bråk från tomt körningar behöver inte tas ut.
6) AVSALTA insamlade fraktioner
För varje fraktion använda en 1 ml vatten Oasis HLB SPE-kassett på följande sätt:
- Fäst antalet nödvändiga patroner att dammsuga grenröret.
- Våt varje patron med 1 ml 80% ACN i 1% myrsyra (vakuummätare på grenröret bör läsa från 5 till 20 lnHg).
- Jämvikt patroner med 1,5 ml 0,1% myrsyra (vakuummätare på grenröret bör läsa från 5 till 20 lnHg)
- Belastning hela volymen av ett prov på en kassett (Vakuummeter på grenröret bör läsa 2 -. 2,5 lnHg, och flöde bör inte överskrida 1 ml / min)
- Tvätta kassetter med 3 x 1 ml 0,1% myrsyra (Vakuummeter på grenröret bör läsa från 5 till 20 lnHg)
- Eluera peptider / glykopeptider i märkta Eppendorf-rör med 1 x 1 ml 80% acetonitril i 0,1% myrsyra. (Vakuummeter på grenröret ska läsa 2 till 2,5 lnHg, och flöde bör inte överskrida 1 ml / min.) En enda samling rör bör användas för varje kassett.
- Neutralisera eluatet genom att tillsätta 60 l 0,5 M ammoniumbikarbonatlösning till varje provröret. Mål neutrOrealiserade pH är 7,0-8,0, testa slutligt pH med pH-indikator papper.
- Koncentrera elueras peptider / glykopeptider till ~ 50 mikroliter genom att köra dem på ett vakuum centrifug (t.ex. en Thermo Savant SpeedVac) för ~ 2 timmar @ 35 ° C.
7) PNGase F-rötning
- Provets pH att säkerställa att det är mellan 7,0 till 8,0. Vid behov, tillsätt 50 bikarbonat mM ammonium att öka pH. Om sista provet volymen är> 100 l, speedvac provet tills det är mellan 50-100 l.
- Tillsätt 0,5 l (250 U) glycerol-fri PNGase F till varje provrör och inkubera vid 37 ° C över natten.
8) Zip Tips prover
- Från och med PNGase F-smält prover, ziptip var och en som följer.
- Våt ziptip med 10 l 100% acetonitril, följt av 10 l 80% acetonitril, 0,1% myrsyra.
- Jämvikt ziptip med 20 l 0,1% myrsyra.
- Ladda provet på ziptip genom att pipettera upp och ner genom ziptip matrisen 10 gånger.
- Tvätta ziptip genom att pipettera 10 l 0,1% myrsyra, 5 gånger.
- Eluera provet i ett rent Eppendorf-rör med 10 l 80% acetonitril, 0,1% myrsyra.
- Upprepa eluering och lägg den andra 10 ìl i samma rör.
- Speedvac proverna till en volym av <2 l.
- Resuspendera prover i 20 l 0,1% myrsyra. Prover är nu redo för analys med LC-MS/MS.
9) representativa resultat:
Den POROS konjugering ger oftast på-pärla lektin koncentrationer i intervallet 2 - 20 mg / ml. Detta är optimal för affinitetskromatografi.
Lektin kromatografi av trypsin smält-Mars-utfiskade humanplasma berikar vanligtvis glykopeptider i den bundna fraktionen. Som glykopeptider är PNGase F-behandlas innan LC-MS/MS, de identifieras som peptider med N-länkade konsensus sekvens, NXS / T (där X är några rester, men prolin), där asparagin har omvandlats till en asparaginsyra genom verkan av PNGase F. peptider med dessa egenskaper anses vara deglycosylated peptider (eller "deglycopeptides"). I genomsnitt genomströmning (FT) fraktionen från AAL eller SNA kromatografi innehåller 2-4% deglycopeptides, medan 30-50% av de peptider som återfanns i bundna fraktionen är deglycopeptides. Vanligtvis med en QStar Elite, kommer 1000-1300 peptider identifieras i FT fraktion, och 200-400 peptider kommer att identifieras i den bundna fraktionen. Två eller fler distinkta invertas deglycopeptides bör observeras i FT fraktion och två eller flera distinkta laktoferrin deglycopeptides i bundna fraktionen (tabell 1).
Tabell 1.
Discussion
Detta protokoll ger en snabb metod för att isolera och identifiera glykopeptider i en glycan-specifika sätt. Eftersom glykosylering varierar i stor utsträckning inom en organism, särskilt under utveckling och patogenes, kan denna teknik tillämpas för att hantera en mängd olika frågor. Framför allt använder vi metoden att selektivt berika glykopeptider som har ändrats med cancer-associerade epitoper som ett första steg mot biomarkörer.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av klinisk proteomik teknik för Cancer initiativ, 5U24CA126477-04.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human plasma | We make this in house | ||
| Human lactoferrin | Sigma-Aldrich | L0520 | Trypsin-digest before use |
| Yeast invertase | Sigma-Aldrich | I0408 | Trypsin-digest before use |
| Oass HLB SPE cartridges | Waters | WAT094225 | 1 cc volume |
| ZipTip pipet tips | Fisher Scientific | ZTC1 8M0 96 | Millipore, C18 for 10 ml pipette |
| Tris | Fisher Scientific | BP154-1 | 99% |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | 99% |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 96% |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | 98% |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 242853 | 99.7% |
| pH indicator paper | Fisher Scientific | M95903 | Range 0-14 |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | 99.9% |
| Formic acid | Pierce, Thermo Scientific | 28905 | 99% |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 14190-136 | Without calcium and magnesium |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | 99.5% |
| PNGase F | New England Biolabs | P0705L | Glycerol-free |
| Vacuum-filter flasks | Fisher Scientific | SCGVU05RE | 0.2 mm pores |
| POROS-AL beads | Applied Biosystems | 1-6028-02 | |
| Aleuria aurantia lectin | Vector Laboratories | L-1390 | |
| Sambucus nigra agglutinin | Vector Laboratories | L-1300 | |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296945 | 5.0 M solution |
References
- Keshishian, H. multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution. Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).
