Summary
Lektin-konjuge Poros boncuk HPLC için istihdam edildi. Glikopeptid standartları, pozitif ve negatif kontroller olarak görev yaptı. MARS-14 tükenmiş, tripsin-sindirilmiş insan plazma Kromatografi ve flow-through (FT) ve bağlı kesirler ESI-LC-MS/MS analizler için toplanmıştır. FT'ye göre glikopeptid bağlı fraksiyon zenginleştirilmiş.
Abstract
Glukanlardır post-translasyonel modifikasyonlar önemli bir sınıf vardır. Genellikle salgılanır ve hücre dışı moleküller üzerinde bulunan, glukanıdır yapıları, hücrenin iç durum sinyali. Tümör hücreleri üzerinde glukanlardır bol miktarda sialik asit ve fucose moieties sahip olma eğilimindedir. Biz, bu kanser ilişkili glukanıdır varyantları erken evre hastalık teşhis amacıyla biyomarker geliştirme için istismar edilmesi öneriyoruz. Buna göre, biz bir kitle lektinleri belirli glukanıdır yapıları bağlayan proteinleri oluşan yakınlık matrisleri kromatografi içermektedir spektrometresi tabanlı iş akışı geliştirdi. Sırasıyla, sialik asit ve fucose bağlayan lektin Sambucus nigra (SNA) ve Aleuria aurantia (AAL), kovalent Poros boncuk (Uygulamalı Biyosistem) birleştiğinde ve yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) PEEK sütunlar halinde dolu. Kısaca, bir çok ilgisi temizleme sistemi (Agilent MARS-14) kullanarak ondört en bol bulunan proteinlerin plazma tükenmiş oldu. Tüketilmiş plazma tripsin-sindirilir ve akış yoluyla ve SNA veya AAL HPLC bağlı fraksiyonları ayrılır. N-bağlı glukanlardır kaldırmak için kesirler PNGaseF ile tedavi ve QStar Elite LC-MS/MS tarafından incelendi. Veriler Maskot yazılımı kullanılarak analiz edildi. Deneysel tasarım kontrolleri fucosylated ve sialylated olumlu dahil insan laktoferrin glikopeptid ve Saccharomyces negatif kontroller yüksek mannoz glikopeptid cerevisiae lektin yakalama özgüllüğü izlemek için kullanılır. Bu iş akışının temel özellikleri glikoprotein standartlar kullanılarak HPLC biçimi, kendi deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifleri yakalanan ve tedavi edilen PNGaseF glikopeptid olumlu kimlik ve kalite değerlendirmesi türetilen tekrarlanabilirlik. Protokolü optimizasyonu da uygun sütun kapasitesinin malzeme başlayan, en verimli yakalama ve yıkama tamponları tespit ve tam deglycosylation emin olmak için PNGaseF tedavi izleme oranının tespitinde dahildir. Gelecek yönde meme kanseri hastalarında ve kontrol bireylerin plazma kütle spektrometresi tabanlı keşif deneyler gerçekleştirmek için bu iş akışını kullanarak.
Protocol
1) lektin-konjuge Poros sütun hazırlayın
- Poros-AL boncuk adımları 1.1 - 1.2 sırasında inhalasyon karşı korumak için bir maske koyun. Poros boncuk istenilen miktarda (100 mg beads/300 ul son hacim) tartılır ve temiz bir Eppendorf tüp içine aktarmak.
- 1 ml fosfat tamponlu salin (PBS) eklenmesi ile boncuk yıkayın. Pelet boncuk, 3 dakika boyunca maksimum hızda bir mikrosantrifüj santrifüj. Süpernatantı ve yıkama tekrarlayın.
- Indirekt lektin istenen miktarda (1 - 4 mg / 200 ul boncuk) tartılır ve temiz bir Eppendorf tüp transfer. 5 formu için PBS - 20 mg / ml. Bu çözüm Rezerv 25 ul.
- Poros boncuk kalan lektin çözüm aktarın. Nihai konsantrasyonu 50 mM sodyum cyanoborohydride ekleyin. Bir rocker tüp yerleştirin ve oda sıcaklığında bir gece tepki. (Not: sodyum cyanoborohydride toksik ve davlumbaz ele alınması gereken Kontamine atıklar uygun şekilde bertaraf edilmelidir.)
- Pelet Poros boncuk adım 1.2 'deki gibi. Süpernatantı ve sonrası konjugasyon çözüm olarak kaydetmek.
- Boncuk 1 ml Quenching Buffer (1 M Tris-Cl, pH 7.4) ile yıkayın. Adım 1.2 ve güvenli bir şekilde Pelet boncuk supernatant atın.
- 1 ml Quenching Tampon Poros boncuk kalan reaktif siteleri engelleme. Nihai konsantrasyonu 50 mM sodyum cyanoborohydride ekleyin. Bir rocker tüp yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Pelet adım 1.2 gibi boncuk ve supernatant atın.
- Boncuk, 1 mL 1 M NaCl ile yıkayın. Pelet boncuk ve supernatant atın. Beş yıkama olmak üzere toplam dört kez tekrarlayın. Boncuk paketi hazır.
- Poros boncuk konjuge protein miktarını belirlemek için, bir protein konsantrasyonu tahlil öncesi konjuge ve post-konjuge lektin çözümleri uygulayın. Konsantrasyonlarda fark boncuklar konjuge protein miktarı. Boncuk hacim başına konjuge protein miktarı boncuklar lektin konsantrasyonu eşittir. Hedef lektin konsantrasyonları 2 -20 mg / ml arasında.
2) bir PEEK sütuna lektin-konjuge Poros boncuk Paketleme
- (Açıklaması) paketleme sistemi kurma ve bir metal halka standı destek. Paketleme sistemi, alttan üst basınç kısıtlayıcı, sonunda sütun elemanı 1, frit, kolon (2 x 50 mm), son sütun coupler 2, sütun konektörü, son sütun elemanı 3, kolon (4.5 x 50 mm), son sütun coupler 4 ve son montaj. Üst kolon ambalaj materyalleri için bir rezervuar olarak hizmet vermektedir.
- Tampon istenilen hacmi Poros boncuk yeniden süspanse (10 mM Tris tamponu, pH 7.4, 150 mM sodyum klorür, 10 mM kalsiyum klorür, 10 mM magnezyum klorür). Eğer ambalaj 400 ul Tampon A. tekrar süspansiyon bir sütun (~ 200 ul yatak hacmi)
- Üst kolon (rezervuar) konjuge Poros boncuk aktarın. Tampon sütunun üst ulaşıncaya kadar rezervuar Bir Bellek ekleyin. Yavaşça, sütun hava kabarcıklarını önlemek için çalışıyoruz, sütun üstüne son montaj yerleştirin. HPLC sistemi üst sütunun sonuna uydurma bağlayın.
- Tampon sistem üzerinden akan sütun paketleyin. 0.5 ml / dak akış hızı ile başlayın. 4 mL / dak veya maksimum basınç (3000 psi) ya ulaşıncaya kadar akış hızı 0.5 ml / dk her dakika artırın. Mümkün olan en yüksek akış hızında Buffer en az 35 ml A sütunu sayesinde geçene kadar devam edin.
- Pompaların kapatın ve <20 psi düşmesi sütun üzerindeki baskıyı izin.
- Yavaşça, üstten başlayarak, paketleme sistemi sökmeye. Son sütun coupler 2 ulaşıldığında, dikkatli bir şekilde kaldırın. Bazı paketlenmiş malzeme sütun üst ekstrüzyon olmalıdır. Bir jilet veya benzer keskin kenar hafifçe sütun üstüne bile bir boncuk yüzeyinde bırakarak, ekstrüzyon boncuk silerek temizleyin. Bunu yaparken boncuklar basınç uygulama yapmayınız.
- Halka standından dolgulu kolon ayırın. Yeni bir bitiş bağlaştırıcısına yeni bir frit yerleştirin ve açık (eski üst) sütun ucunda frit / bitiş coupler ile bağlamak için dolgulu kolon ters çevirin.
- Sütunu uygun şekilde etiketleyin. Artık kullanıma hazırdır. 6 aya kadar, sütun 4% 0.02 sodyum azid ° C ile PBS içinde saklanabilir olabilir.
3) Program HPLC yöntemi
- HPLC programlama ayrıntıları üretici yazılım özelliklerine göre değişecektir. Biz bir Michrom Paradigma MG4 HPLC kullanın. Bu makine üzerinde, ekranın üst kısmında yöntemleri inşa ve "Setup" sekmesi altında erişilebilir. Programı aşağıdaki yöntemi:
Zaman Akış hızı (ul / dak) % A % B 00:00 50 100 0 09:00 50 100 0 09:01 500 0 100 13:50 500 0 100 13:51 3000 100 0 19:50 3000 100 0
10 mM Tris tamponu, pH 7.4, 150 mM sodyum klorür, 10 mM kalsiyum klorür, 10 mM magnezyum klorür: arabelleğe
Tampon B: 0,5 M asetik asit
280 nm UV detektör 0:00 ile 19:50 okumak için programlanabilir olmalıdır. - 50 AU y ekseni düşük absorbans seviyeleri, örneğin, 0 algılamak için ayarlanabilir olmalıdır. - Otomatik örnekleyici, program fraksiyon toplanması için aşağıdaki programa ise. Aksi takdirde, kromatografi performans zaman belirtildiği gibi elle kesirleri toplamak.
Kesir Numune enjeksiyon toplama gecikme Toplama süresi (dakika) Flow-through 2,8 4,1 Bağlı 9 2,6
4) HPLC için örnek hazırlayın
- Bu protokolü kullanmak için önce, insan plazma MARS sütun (Santa Clara, CA Agilent) kullanarak 14 en bol proteinler tükenmiş olmalıdır. Tüketilmiş plazma, insan laktoferrin ve maya invertaz ayrı ayrı tripsin sindirilir ve önceden 1'de açıklandığı gibi, desalted olmalıdır .
- Lektin özel laktoferrin standart hazırlamak için, Bölüm 3 yöntemi kullanarak AAL veya SNA sütun üzerinde 50 ug tripsin-sindirilmiş laktoferrin kromatografi gerçekleştirin. Bağlı fraksiyonu lektin özel laktoferrin glikopeptid içerecektir. Bölüm 6 Kısım 4.4 'te gibi örnekleri ve desalt nötralize eder. Çıkan örnek kullanıma hazırdır, 1 ml Tampon A. örnek tekrar
- Üç deneysel yapılacaktır çoğaltır. Üç numune hazırlamak için çoğaltır, 30 ul MARS-tükenmiş, tripsin-sindirilmiş, plazma benzerleri (PE), tripsin sindirilir invertaz 3 pmol ve lektin özel laktoferrin (ya AAL-LAC veya SNA-LAC) 1 ul ekleyin. PE işlenmiş plazma (MARS yetersizliği ve tripsin sindirilir) belirli bir miktar elde edildiği non-processed/intact/original plazma hacmi olarak tanımlanır. 330 ul son bir hacme ulaşmak için örnek bir Tampon ekleyin.
- Eluat toplayacak numune şişeleri, nötralizasyon tampon (1 M Tris pH: 8.0) ekleyin. Sizinle birlikte çalışmaktan şişeleri sayısı ve hacmi, sizin otosampler kısıtlamaları bağlıdır. MG4 Paradigma için, bir flakon flow-through ve iki eluat toplamak toplar. Yaklaşık 1.5 ml Tris tampon eluat 1 mL nötralize gerekecektir. Hedef nötralize pH 7,0-8,0; pH indikatör kağıdı ile test test nihai pH.
5) kromatografisi gerçekleştirin
- Izleyen tüm boş ve örnek çalışır Bölüm 1'de anlatılan yöntemi kullanın. Sütun ve tamponlar, kullanım sırasında oda sıcaklığında. Tamponlar oda sıcaklığında saklandığında ise sütunlar, 4 ° C'de saklanır.
- HPLC sistemi ya AAL veya SNA lektin sütununda takın ve iki boş yöntemleri (sadece Tampon enjekte A) çalıştırın. Lektin sütun lektin özel laktoferrin (Bölüm 2) uygun olduğundan emin olun.
- Toplam 7 HPLC çalışır, her enjekte örnek arasında boş bir enjekte üç plazma numuneleri kromatograflanır. Boş çalışır Kesirler toplanmasına gerek yoktur.
6) Desalt toplanan fraksiyonları
Her bir kısmı aşağıdaki gibi bir 1 ml Waters Oasis HLB SPE kartuş kullanmak için:
- Vakum manifoldunun için gerekli kartuşları takın.
- Her bir kartuş% 1 formik asit 1 ml% 80 ACN (20 lnHg manifoldu vakum göstergesi 5 okumalısınız) ile ıslatın.
- 1.5 ml 0.1% Formik asit (20 lnHg manifoldu vakum göstergesi 5 okumalısınız) ile kartuşları dengelenmesi
- Bir kartuş (- 2,5 lnHg ve akış hızı 1 ml / dk geçmemelidir manifoldu üzerinde Vakum göstergesi 2 okumalısınız) üzerine bir örnek tüm hacim yükleyin
- 3 x 1 ml% 0.1 formik asid (20 lnHg manifoldu vakum göstergesi 5 okumalısınız) ile kartuşları yıkayın
- 1 x 1 ml% 0.1 formik asit% 80 asetonitril içine Zehir peptidler / glikopeptid Eppendorf tüpleri etiketli. Tek bir toplama tüpü her kartuş için kullanılmalıdır (2.5 lnHg, ve akış hızı 1 ml / dk geçmemelidir manifoldunun üzerine Vakum göstergesi 2 okumalısınız.)
- Her bir toplama tüpüne 60 ul 0.5 M amonyum bikarbonat ekleyerek eluat nötralize. Hedef nötralized pH 7,0-8,0; pH indikatör kağıdı ile test nihai pH.
- ~ 2 saat 35 ° C (örneğin, Thermo Savant SpeedVac) bir vakum santrifüj çalışan tarafından yıkandı, peptidler / ~ 50 mcL glikopeptid Konsantre
7) PNGase F-sindirim.
- Emin olmak için test örneği pH 7,0 - 8,0 arasındadır. Gerekirse, 50 mM pH artırmak için amonyum bikarbonat ekleyin. Ul 50-100 arasında olduğu kadar son örnek hacmi> 100 ul, speedvac örneğidir.
- 37 ° C gecede her bir numune tüpü ve inkübe ul 0.5 (250 U) gliserol-PNGase F ekleyin.
8) Zip İpucu örnekleri
- PNGase F-sindirilmiş örnekleri ile başlayarak, aşağıdaki gibi her biri ziptip.
- 10 ul 100% asetonitril, 10 ul% 80 asetonitril,% 0.1 formik asit takip Islak ziptip.
- 20 ul% 0.1 formik asite ziptip dengeye.
- Ziptip matris üzerinden 10 kat yukarı ve aşağı pipetleme ziptip üzerine örnek yükleyin.
- 10 ul% 0.1 formik asit, 5 kez pipetleme ziptip yıkayın.
- 10 ul% 80 asetonitril,% 0.1 formik asit ile temiz bir Eppendorf tüp içine örnek Zehir.
- Elüsyon tekrarlayın ve aynı tüpe ikinci 10 ul eklemek.
- <2 ul bir ses örnekleri Speedvac.
- 20 ul% 0.1 formik asite süspanse edin örnekleri. Örnekleri LC-MS/MS analiz için hazır.
9) Temsilcisi Sonuçlar:
20 mg / ml - Poros konjugasyon genellikle 2 aralığında on-boncuk lektin konsantrasyonları elde edilir. Bu afinite kromatografisi için en uygunudur.
Tripsin sindirilir MARS-tükenmiş insan plazma lektin kromatografi genellikle bağlı bir fraksiyon olarak glikopeptid zenginleştirir. Glikopeptid PNGase önce LC-MS/MS F-tedavi olarak, N-bağlantılı bir konsensüs sırası ile peptitler olarak tanımlanır asparajin dönüştürülür edildiği NXS / T (burada X herhangi bir kalıntı ama prolin), PNGase F. Peptitler eylem yoluyla bu özelliklere sahip bir aspartik asit deglycosylated peptidler (veya "deglycopeptides") olarak kabul edilir. Bağlı bir fraksiyon olarak ele peptidlerin% 30-50 deglycopeptides ise ortalama akış-through (FT) AAL veya SNA kromatografisi fraksiyonu,% 2-4 oranında deglycopeptides bulunur. Tipik olarak, bir QStar Elite kullanarak, 1000-1300 peptidler FT fraksiyonu tespit olacak ve 200-400 peptidler bağlı bir fraksiyon olarak tespit edilecektir. İki veya daha fazla farklı Invertase deglycopeptides FT fraksiyonu ve bağlı fraksiyonu (Tablo 1) iki veya daha fazla farklı laktoferrin deglycopeptides dikkat edilmelidir.
Tablo 1.
Discussion
Bu protokol, glikopeptid glukanıdır özel bir şekilde izole etmek ve tanımlamak için hızlı bir yöntem sağlar. Glikozilasyon geliştirme ve patogenezi sırasında bir organizmanın içinde yaygın olarak değişir, bu teknik sorular geniş bir yelpazede adresi için geçerli olabilir. Özellikle, kanser ilişkili epitoplar biyomarker keşfi yolunda bir ilk adım olarak modifiye edilmiş glikopeptid seçici zenginleştirmek için yöntem kullanıyor.
Acknowledgments
Bu çalışma Kanser girişimi, 5U24CA126477-04 Klinik Proteomik Technologies tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human plasma | We make this in house | ||
| Human lactoferrin | Sigma-Aldrich | L0520 | Trypsin-digest before use |
| Yeast invertase | Sigma-Aldrich | I0408 | Trypsin-digest before use |
| Oass HLB SPE cartridges | Waters | WAT094225 | 1 cc volume |
| ZipTip pipet tips | Fisher Scientific | ZTC1 8M0 96 | Millipore, C18 for 10 ml pipette |
| Tris | Fisher Scientific | BP154-1 | 99% |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | 99% |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 96% |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | 98% |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 242853 | 99.7% |
| pH indicator paper | Fisher Scientific | M95903 | Range 0-14 |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998 | 99.9% |
| Formic acid | Pierce, Thermo Scientific | 28905 | 99% |
| Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 14190-136 | Without calcium and magnesium |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | 99.5% |
| PNGase F | New England Biolabs | P0705L | Glycerol-free |
| Vacuum-filter flasks | Fisher Scientific | SCGVU05RE | 0.2 mm pores |
| POROS-AL beads | Applied Biosystems | 1-6028-02 | |
| Aleuria aurantia lectin | Vector Laboratories | L-1390 | |
| Sambucus nigra agglutinin | Vector Laboratories | L-1300 | |
| Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 296945 | 5.0 M solution |
References
- Keshishian, H. multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution. Mol Cell Proteomics. 6, 2212-2229 (2007).
