Una lectina Método HPLC para enriquecer péptidos selectivamente glicosilada de muestras biológicas complejas

Summary

Lectina conjugada con perlas de Poros fueron empleados para HPLC. Normas glicopéptido sirvieron como controles positivos y negativos. MARS-14 empobrecido, tripsina digerido plasma humano y se sometió a cromatografía de flujo continuo (FT) y las fracciones recogidas obligado para el análisis de ESI-LC-MS/MS. Glicopéptidos fueron enriquecidos en la fracción unida en comparación con el FT.

Abstract

Los glicanos son una clase importante de modificaciones post-traduccionales. Por lo general se encuentran en las moléculas secretadas y extracelular, las estructuras de glicanos de la señal del estatuto interno de la célula. Glicanos en las células tumorales tienden a tener el ácido siálico y abundantes restos de fucosa. Proponemos que estas variantes asociadas con el cáncer de glicanos ser explotado para el desarrollo de biomarcadores destinados a diagnosticar enfermedad en estadio inicial. En consecuencia, hemos desarrollado una espectrometría de masas basado en flujo de trabajo que incorpora la cromatografía de afinidad sobre matrices formado a partir de las lectinas, proteínas que se unen las estructuras específicas de glicanos. Las lectinas Sambucus nigra (SNA) y aurantia Aleuria (AAL), que se unen el ácido siálico y fucosa, respectivamente, se acoplaron de forma covalente a cuentas POROS (Applied Biosystems) y se introduce en columnas PEEK para cromatografía líquida de alta presión (HPLC). En pocas palabras, el plasma se agotó de los catorce proteínas más abundantes con un sistema de eliminación de afinidad múltiples (MARS-14; Agilent). Agotado el plasma fue digerido con tripsina y se separaron en el filtrado y fracciones obligado por SNA o HPLC AAL. Las fracciones fueron tratados con PNGaseF para eliminar la N-glicanos ligados, y se analizaron por LC-MS/MS en Elite QStar. Los datos fueron analizados utilizando el software mascota. El diseño experimental incluye controles positivos-fucosilados y sialylated humanos glicopéptidos y lactoferrina negativos los controles de altura glicopéptidos manosa de Saccharomyces cerevisiae, que se utiliza para controlar la especificidad de la captura de lectina. Las principales características de este flujo de trabajo incluyen la reproducibilidad derivado del formato de HPLC, la identificación positiva de los glicopéptidos capturado y PNGaseF tratos de sus motivos Asn-Xxx-Ser/Thr desamidado y evaluación de la calidad con las normas glicoproteína. Optimización del protocolo también incluye la determinación de la proporción adecuada de material de partida a la capacidad de la columna, la identificación de la captura más eficiente y tampones de elución, y el control de la PNGaseF-tratamiento para asegurarse de deglicosilación completo. Direcciones futuras incluyen el uso de este flujo de trabajo para llevar a cabo la espectrometría de masas basado en experimentos de detección en plasma de pacientes con cáncer de mama y el control de los individuos.

Protocol

1) Prepare lectina conjugada columnas POROS

1. Se puso una máscara para protegerse contra la inhalación de los poros-AL cuentas durante los pasos de 1,1 a 1,2. Pesar la cantidad deseada de granos POROS (100 mg beads/300 volumen final l) y la transferencia en un tubo eppendorf limpio.
2. Lávese las cuentas con la adición de 1 mL de buffer fosfato salino (PBS). Pellet cuentas por centrifugación en una microcentrífuga a máxima velocidad durante 3 minutos. Aspirar el sobrenadante y repetir el lavado.
3. Pesar la cantidad necesaria de lectina conjugada (1 - 4 mg / l 200 cuentas) y transferir a un tubo eppendorf limpio. Añadir PBS para formar un 5 a 20 mg / ml de solución. Reserva 25 l de esta solución.
4. Transferir la solución de lectina restantes a las cuentas poros. Añadir cianoborohidruro de sodio para una concentración final de 50 mM. Coloque el tubo en una mecedora y reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. (Nota:. Cianoborohidruro de sodio es tóxico y debe ser manejado en una campana de extracción de residuos contaminados deben eliminarse de manera apropiada.)
5. Se precipitan los poros cuentas como en el paso 1.2. Aspirar el sobrenadante y guardar como la solución después de la conjugación.
6. Lávese las cuentas con un Buffer enfriamiento ml (1 M Tris-Cl, pH 7,4). Cuentas de pellets como en el paso 1.2 y de manera segura eliminar el sobrenadante.
7. Bloquear los sitios restantes reactiva en las cuentas de poros con un búfer de enfriamiento ml. Añadir cianoborohidruro de sodio para una concentración final de 50 mM. Coloque el tubo en una mecedora y se incuban a temperatura ambiente durante 30 min.
8. Pellet cuentas como en el paso 1.2 y desechar el sobrenadante.
9. Lávese las cuentas con 1 ml de NaCl 1 M. Pellet cuentas y eliminar el sobrenadante. Repetir cuatro veces para un total de cinco lavados. Las cuentas ya están listos para empacar.
10. Para determinar la cantidad de proteína que se conjugó con las cuentas de Poros, realizar un ensayo de la concentración de proteínas en las soluciones de la lectina de pre-y post-conjugado conjugados. La diferencia en las concentraciones es la cantidad de proteína que se conjugó con las cuentas. La cantidad de proteína conjugada por volumen de cuentas es igual a la concentración de lectina en los granos. Las concentraciones objetivo lectina son entre 2 -20 mg / ml.

2) Embalaje de la cuentas de lectina conjugada con poros en una columna de PEEK

1. Montar el sistema de empaque (descripción a continuación) y el apoyo en un soporte de anillo de metal. El sistema de embalaje se compone de, de abajo hacia arriba, limitador de presión, columna extremo del acoplador 1, frita, la columna (2 x 50 mm), acoplamiento final la columna 2, conector de columna, columna extremo del acoplador 3, columna (4,5 x 50 mm), columna extremo del acoplador 4 y montaje final. La columna superior sirve como depósito para el material de embalaje.
2. Volver a suspender las cuentas de poros en el volumen deseado de un Buffer. (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM de cloruro de sodio, cloruro de calcio 10 mM, 10 mM de cloruro de magnesio) Si una columna de embalaje (~ 200 l de volumen de lecho), resuspender en 400 A. Buffer l
3. Transferencia conjugado cuentas POROS en la columna superior (el depósito). Añadir un Buffer para el depósito hasta que el buffer llega a la parte superior de la columna. Coloque con cuidado el conector de extremo en la parte superior de la columna, tratando de evitar burbujas de aire en la columna. Conecte el montaje final de la columna superior a la del sistema HPLC.
4. Paquete de la columna por la que fluye el tampón A través del sistema. Comience con un caudal de 0,5 mL / min. Aumentar la tasa de flujo de 0,5 mL / min cada minuto hasta que 4 ml / min o la presión máxima (3000 psi) se ha alcanzado. Continuar en la tasa de flujo máximo posible hasta por lo menos 35 ml de tampón A han pasado por la columna.
5. Apague la bomba y deje que la presión en la columna para bajar a <20 psi.
6. Suavemente, desmontar el sistema de empaque, a partir de la parte superior. Al final de la columna 2 del acoplador se alcanza, quite cuidadosamente. Parte del material de envasado deberá extrusión de la parte superior de la columna. Con una navaja o filo similar, limpie suavemente lejos de la extrusión de cuentas, dejando una superficie de cuentas que es con la parte superior de la columna. No presione a las perlas mientras hace esto.
7. Desenganche la columna de relleno de la parada de anillo. Coloque una frita de nuevo en un acoplador de nuevo final y gire a la columna de relleno más que conectarse con el acoplador de frita / final en el extremo de la columna abierta (anteriormente parte superior).
8. Etiqueta de la columna apropiada. Ahora está listo para su uso. Cuando no esté en uso, la columna puede ser almacenada en PBS con azida de sodio 0,02% a 4 ° C durante un máximo de 6 meses.

3) Programa de la HPLC método

1. Los detalles de la programación de la HPLC pueden variar de acuerdo a las especificaciones de software del fabricante. Utilizamos un paradigma Michrom MG4 HPLC. En este equipo, los métodos de crear y acceder en la sección "Configuración" en la parte superior de la pantalla. Programa de la siguiente forma:
   

   Tiempo	Caudal (l / min)	% A	% B
   0:00	50	100	0
   09:00	50	100	0
   09:01	500	0	100
   13:50	500	0	100
   13:51	3000	100	0
   19:50	3000	100	0

   
   Tampón A: 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM de cloruro de sodio, cloruro de calcio 10 mM, 10 mM de cloruro de magnesio
   Tampón B: 0,5 M de ácido acético
   El detector de UV debe ser programado para leer a 280 nm a partir de las 0:00 a las 19:50. El eje debe ser ajustado para detectar bajos niveles de absorción, por ejemplo, 0 - 50. UA.
2. Si es un muestreador automático de programas disponibles, el siguiente calendario para la recogida de fracción. De lo contrario, recoger las fracciones con la mano como lo indica la hora de realizar la cromatografía.
   

   Fracción	Demora a la recogida de inyección de la muestra	Duración de la colección (min)
   Flujo a través de	2.8	4.1
   Obligado	9	2.6

4) Preparación de muestras para HPLC

1. Antes de su uso en este protocolo, el plasma humano deberá ser agotado de las 14 proteínas más abundante con una columna de MARS (Agilent, Santa Clara, CA). Agotado plasma, la lactoferrina humana y la invertasa de levadura debe ser individual tripsina digerido y como se describió previamente desalado ^1.
2. Para preparar la lectina específica de la lactoferrina estándar, realice una cromatografía en 50 ug tripsina digerido lactoferrina sobre cualquiera de la AAL, o la columna SNA utilizando el método en la parte 3. La fracción unida se contienen lectina específica de glicopéptidos lactoferrina. Neutralizar las muestras como en la parte 4.4, y desalar como en la Parte 6. Resuspender la muestra en un ml de tampón A. La muestra resultante está listo para su uso.
3. Tres réplicas experimentales se llevarán a cabo. Para preparar la muestra para tres repeticiones, añadir 3 pmol de tripsina digerido invertasa y 1 l de lectina específica de la lactoferrina (ya sea AAL-LAC o SNA-LAC) y 30 l MARS-agotado, tripsina digerido equivalentes de plasma, (PE). PE se define como el volumen de plasma non-processed/intact/original del que se deriva una cantidad dada de procesado de plasma (MARS-agotado y tripsina digerido). Añadir un Buffer de la muestra para llegar a un volumen final de 330 microlitros.
4. Añadir tampón de neutralización (1 M Tris pH 8,0), a los viales de muestra que recogerá eluido. El número y el volumen de los viales que trabajan con dependerá de las limitaciones de su cargador de muestras. Para el paradigma MG4, un vial recoge el flujo continuo y dos recoger el eluido. Se requieren aproximadamente 1,5 ml de tampón Tris para neutralizar 1 ml de eluido. PH neutralizado objetivo es 7.0-8.0; prueba del pH prueba final con papel indicador de pH.

5) Realizar la cromatografía

1. Todas las carreras en blanco y la muestra que siguen se utilizará el método descrito en la Parte 1. La columna y tampones están a temperatura ambiente durante su uso. Las columnas se almacenan a 4 ° C, mientras que los amortiguadores son almacenados a temperatura ambiente.
2. Sujetar el AAL o la columna de lectina SNA en el sistema HPLC y ejecutar dos métodos en blanco (inyección de búfer sólo una). Asegúrese de que la columna de lectina corresponde a la lactoferrina lectina específica (Parte 2).
3. Cromatógrafo de las tres muestras de plasma, la inyección de un espacio en blanco entre cada muestra inyectada, para un total de 7 carreras por HPLC. Las fracciones de carreras en blanco no será preciso recoger.

6) Desalar fracciones recogidas

Para cada fracción de utilizar una de 1 ml Agua Oasis HLB SPE cartucho de la siguiente manera:

1. Coloque el número de cartuchos para colector de vacío.
2. Húmedo cada cartucho con un ACN mL 80% en 1% de ácido fórmico (medidor de vacío en el colector debe leer 5-20 LNHG).
3. Equilibrar los cartuchos con 1,5 ml de ácido fórmico al 0,1% (medidor de vacío en el colector debe leer 5-20 LNHG)
4. Volumen de carga total de una muestra en un cartucho (medidor de vacío en el colector debe leer 2 - 2.5. LNHG, y el caudal no debe exceder de 1 ml / min)
5. Lavado de los cartuchos con 3 x 1 ml de ácido fórmico al 0,1% (medidor de vacío en el colector debe leer 5-20 LNHG)
6. Péptidos eluir / glucopéptidos en tubos eppendorf marcados con una x 1% de acetonitrilo 80 ml en el 0,1% de ácido fórmico. (Medidor de vacío en el colector debe leer 2-2,5 LNHG, y el caudal no debe exceder de 1 mL / min.) Un tubo de recolección solo se debe utilizar para cada cartucho.
7. Neutralizar eluido mediante la adición de 60 l de bicarbonato de amonio 0,5 M a cada tubo de recolección. Objetivo neutrpH industrializados se está 7,0-8,0; pH prueba final con papel indicador de pH.
8. Concentrado péptidos eluidos / glicopéptidos a ~ 50 l por su ejecución en una centrífuga de vacío (por ejemplo, un Thermo Savant SpeedVac) de ~ 2 horas a 35 ° C.

7) PNGase F-digestión

1. Prueba del pH de la muestra para asegurarse de que es entre 7,0 a 8,0. Si es necesario, añada bicarbonato amónico 50 mM para aumentar el pH. Si el volumen final de la muestra es> 100 l de la muestra, speedvac hasta que esté entre 50 a 100 microlitros.
2. Añadir 0,5 l (250 U) de glicerol libre F PNGase a cada tubo de muestra y se incuba a 37 ° C durante la noche.

8) Ejemplos de Código Postal Consejo

1. A partir de PNGase F-digerido muestras, ZipTip cada uno de ellos de la siguiente manera.
2. ZipTip húmedo con 10 l de acetonitrilo 100%, seguido de 10 l de acetonitrilo 80%, 0,1% de ácido fórmico.
3. Equilibre ZipTip con 20 l de ácido fórmico al 0,1%.
4. Cargar la muestra en la ZipTip pipeteando arriba y abajo a través de la matriz ZipTip 10 veces.
5. Lave la ZipTip pipeteando 10 l de ácido fórmico al 0,1%, cinco veces.
6. Eluir la muestra en un tubo eppendorf limpio con 10 l de acetonitrilo 80%, 0,1% de ácido fórmico.
7. Repetir la elución y añadir el segundo 10 l en el mismo tubo.
8. Speedvac las muestras a un volumen de <2 l.
9. Resuspender en 20 muestras de ácido fórmico l 0,1%. Las muestras ya están listos para ser analizados por LC-MS/MS.

9) Los resultados representativos:

La conjugación POROS produce normalmente en concentraciones de lectina de cuentas en el rango de 2 a 20 mg / ml. Esto es óptimo para la cromatografía de afinidad.

Cromatografía de lectina de la tripsina digerido plasma MARS-agotado humanos normalmente enriquece glucopéptidos en la fracción unida. Como los glicopéptidos están PNGase F-tratada antes de LC-MS/MS, son identificadas como péptidos con la secuencia consenso de N-ligado, NXS / T (donde X es cualquier residuo, pero prolina), en el que se ha convertido en la asparagina un ácido aspártico por la acción de F. PNGase péptidos con estas características se considera que los péptidos deglicosilada (o "deglycopeptides"). En promedio, el flujo a través de (FT) de la fracción de AAL o cromatografía SNA contiene deglycopeptides 4.2%, mientras que el 30-50% de los péptidos se recuperó en la fracción unida se deglycopeptides. Por lo general, utilizando un Elite QStar, 1000-1300 péptidos se identificaron en la fracción de FT, y 200-400 péptidos se identificarán en la fracción unida. Dos o más deglycopeptides invertasa distintos deben ser observados en la fracción de FT y dos o más distintos deglycopeptides lactoferrina en la fracción unida (Tabla 1).

Tabla 1.

Discussion

Este protocolo proporciona un método rápido para el aislamiento y la identificación de los glucopéptidos en forma de glicanos específicos. Como la glicosilación varía ampliamente dentro de un organismo, en particular durante el desarrollo y patogénesis, esta técnica puede aplicarse para hacer frente a una amplia variedad de preguntas. En particular, estamos usando el método para enriquecer selectivamente glicopéptidos que han sido modificados con cáncer asociado a epítopos como un primer paso hacia el descubrimiento de biomarcadores.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human plasma			We make this in house
Human lactoferrin	Sigma-Aldrich	L0520	Trypsin-digest before use
Yeast invertase	Sigma-Aldrich	I0408	Trypsin-digest before use
Oass HLB SPE cartridges	Waters	WAT094225	1 cc volume
ZipTip pipet tips	Fisher Scientific	ZTC1 8M0 96	Millipore, C18 for 10 ml pipette
Tris	Fisher Scientific	BP154-1	99%
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	A6141	99%
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901	96%
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	98%
Acetic acid	Sigma-Aldrich	242853	99.7%
pH indicator paper	Fisher Scientific	M95903	Range 0-14
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998	99.9%
Formic acid	Pierce, Thermo Scientific	28905	99%
Phosphate-buffered saline	Invitrogen	14190-136	Without calcium and magnesium
Sodium azide	Sigma-Aldrich	71289	99.5%
PNGase F	New England Biolabs	P0705L	Glycerol-free
Vacuum-filter flasks	Fisher Scientific	SCGVU05RE	0.2 mm pores
POROS-AL beads	Applied Biosystems	1-6028-02
Aleuria aurantia lectin	Vector Laboratories	L-1390
Sambucus nigra agglutinin	Vector Laboratories	L-1300
Sodium cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	296945	5.0 M solution