एक lectin HPLC परिसर जैविक नमूने से चुनिंदा-ग्लाइकोसिलेटेड पेप्टाइड्स समृद्ध विधि

Summary

Lectin संयुग्मित POROS मोती HPLC के लिए कार्यरत थे. Glycopeptide मानकों को सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा की. समाप्त मार्स-14, trypsin पचा मानव प्लाज्मा chromatographed था और प्रवाह के माध्यम से (एफटी) और बाध्य भिन्न ESI-LC-MS/MS विश्लेषण के लिए एकत्र. Glycopeptides बाध्य अंश में समृद्ध थे एफटी की तुलना में.

Abstract

Glycans बाद translational संशोधनों के एक महत्वपूर्ण वर्ग हैं. आमतौर पर secreted और कोशिकी अणुओं पर पाया, glycan संरचनाओं कक्ष की आंतरिक स्थिति का संकेत है. Glycans ट्यूमर कोशिकाओं पर प्रचुर मात्रा में सियालिक एसिड और fucose moieties करते हैं. हम प्रस्ताव है कि इन कैंसर से जुड़े glycan वेरिएंट biomarker विकास के लिए प्रारंभिक अवस्था रोग के निदान करने के उद्देश्य से शोषण किया. तदनुसार, हम एक जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित वर्कफ़्लो कि आत्मीयता lectins, प्रोटीन है कि विशिष्ट glycan संरचनाओं बाँध से गठित matrices पर क्रोमैटोग्राफी शामिल विकसित की है. lectins Sambucus nigra (SNA) और Aleuria aurantia (AAL), जो सियालिक एसिड और fucose बाँध, क्रमशः covalently POROS मोती (एप्लाइड Biosystems) युग्मित कर रहे थे और उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) के लिए तिरछी नज़र स्तंभों में पैक. संक्षेप में, प्लाज्मा चौदह सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की एक बहु आत्मीयता हटाने प्रणाली (Agilent, मार्स-14) का उपयोग समाप्त किया गया था. समाप्त प्लाज्मा trypsin पचा और प्रवाह के माध्यम से और SNA या AAL HPLC से बंधे भिन्न में विभाजित था. भिन्न PNGaseF के साथ इलाज किया गया एन जुड़े glycans हटायें, और एक QStar अभिजात वर्ग पर LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण. शुभंकर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा विश्लेषण किया गया. प्रयोगात्मक डिजाइन सकारात्मक शामिल नियंत्रण - fucosylated और sialylated मानव लैक्टोफेरिन glycopeptides और Saccharomyces से नकारात्मक नियंत्रण उच्च mannose glycopeptides cerevisiae कि लेक्टिन कब्जा की विशिष्टता की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया. इस वर्कफ़्लो के मुख्य विशेषताएं HPLC स्वरूप, उनके deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr रूपांकनों से कब्जा कर लिया और PNGaseF इलाज glycopeptides की सकारात्मक पहचान, और गुणवत्ता मूल्यांकन ग्लाइकोप्रोटीन मानकों का उपयोग कर से व्युत्पन्न reproducibility शामिल हैं. प्रोटोकॉल अनुकूलन भी स्तंभ क्षमता सामग्री शुरू, सबसे कुशल कब्जा और elution buffers की पहचान और PNGaseF उपचार की निगरानी के लिए पूरा deglycosylation सुनिश्चित करने के उचित अनुपात का निर्धारण भी शामिल है. भविष्य दिशाओं इस वर्कफ़्लो का उपयोग करने के लिए स्तन कैंसर के रोगियों और नियंत्रण व्यक्तियों से प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित खोज प्रयोगों प्रदर्शन शामिल हैं.

Protocol

1) लेक्टिन संयुग्मित POROS स्तंभों की तैयारी

1. एक मुखौटा पर रखो 1.1 चरणों के दौरान POROS अल मोतियों की साँस लेना के खिलाफ की रक्षा - 1.2. POROS मोती के वांछित राशि की (100 मिलीग्राम beads/300 μl अंतिम मात्रा) वजन और एक साफ Eppendorf ट्यूब में स्थानांतरित.
2. 1 एमएल फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के अलावा के साथ मोती धो लें. 3 मिनट के लिए अधिकतम गति पर एक microcentrifuge में centrifugation द्वारा गोली मोती. निकालें सतह पर तैरनेवाला और धोने दोहराने.
3. Unconjugated लेक्टिन के वांछित राशि (1 - 4 मिलीग्राम / 200 μl मोती) वजन और एक साफ Eppendorf ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण. पीबीएस जोड़ें एक 5 फार्म - 20 मिलीग्राम / एमएल समाधान. इस समाधान के रिजर्व 25 μl.
4. शेष लेक्टिन POROS मोती के समाधान स्थानांतरण. 50 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता सोडियम cyanoborohydride जोड़ें. एक झूली कुरसी पर ट्यूब प्लेस और कमरे के तापमान पर रातोंरात प्रतिक्रिया. (नोट: सोडियम cyanoborohydride विषैला होता है और एक धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए दूषित बेकार उचित रूप से निपटाया जाना चाहिए.)
5. गोली के रूप में 1.2 चरण में POROS मोती. सतह पर तैरनेवाला निकालें और बाद संयुग्मन समाधान के रूप में बचाने के.
6. 1 एमएल शमन बफर (1 Tris-सीएल एम, पीएच 7.4) के साथ मोती धो लें. 1.2 कदम में और सुरक्षित के रूप में गोली मोती सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
7. 1 एमएल शमन बफर के साथ POROS मोती पर शेष प्रतिक्रियाशील साइटों को ब्लॉक. 50 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता सोडियम cyanoborohydride जोड़ें. एक झूली कुरसी पर ट्यूब प्लेस और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
8. 1.2 चरण में के रूप में गोली माला और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
9. 1 एमएल 1 एम NaCl के साथ मोती धो लें. गोली माला और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. पांच washes के एक कुल के लिए चार बार दोहराएँ. मोती अब कर रहे हैं पैक करने के लिए तैयार हैं.
10. प्रोटीन की मात्रा कि POROS मोती संयुग्मित किया गया था निर्धारित करने के लिए, पूर्व संयुग्मित और बाद संयुग्मित लेक्टिन समाधान पर एक प्रोटीन एकाग्रता परख करते हैं. सांद्रता में अंतर प्रोटीन की मात्रा है कि मोती संयुग्मित था है. मनका मात्रा प्रति संयुग्मित प्रोटीन की मात्रा मनकों पर लेक्टिन की एकाग्रता के बराबर होती है. टारगेट लेक्टिन सांद्रता 2 -20 मिलीग्राम / एमएल के बीच हैं.

2) एक तिरछी नज़र स्तंभ में पैकिंग लेक्टिन संयुग्मित POROS मोती

1. पैकिंग सिस्टम (विवरण निम्नानुसार) इकट्ठा और यह एक धातु की अंगूठी स्टैंड पर समर्थन. , नीचे से ऊपर, दबाव restrictor, अंत स्तंभ 1 युग्मक, मिलाना, स्तंभ (2 x 50 मिमी), अंत स्तंभ 2 युग्मक, स्तंभ संबंधक, अंत स्तंभ युग्मक 3, स्तंभ (4.5 x 50 मिमी), पैकिंग सिस्टम होते हैं अंत स्तंभ युग्मक 4 और अंत फिटिंग. ऊपरी स्तंभ पैकिंग सामग्री के लिए एक जलाशय के रूप में कार्य करता है.
2. बफर की वांछित मात्रा में POROS मोती Resuspend (10 मिमी बफर Tris, 7.4 पीएच, 150 मिमी सोडियम क्लोराइड, 10 मिमी कैल्शियम क्लोराइड, 10 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड). यदि एक स्तंभ (~ 200 μl बिस्तर मात्रा), 400 μl बफर ए में resuspend पैकिंग
3. ऊपरी स्तंभ (जलाशय) में संयुग्मित POROS मोती स्थानांतरण. जलाशय के लिए एक बफर में जोड़ें जब तक बफर स्तंभ के ऊपर तक पहुँचता है. धीरे स्तंभ के शीर्ष पर अंत फिटिंग जगह स्तंभ में हवाई बुलबुले से बचने की कोशिश कर रहा है. HPLC प्रणाली के लिए ऊपरी स्तंभ के अंत फिटिंग कनेक्ट.
4. बफर प्रणाली के माध्यम से बह स्तंभ पैक. 0.5 एमएल / मिनट की एक प्रवाह की दर के साथ शुरू करो. 0.5 एमएल / मिनट प्रत्येक मिनट से प्रवाह की दर बढ़ाएँ जब तक या तो 4 एमएल / न्यूनतम या अधिकतम दबाव (3000 साई) तक पहुँच गया है. अधिकतम संभव प्रवाह की दर में जारी रखें जब तक बफर के कम से कम 35 एमएल एक स्तंभ के माध्यम से पारित कर दिया है.
5. बंद पंपों मुड़ें और स्तंभ पर दबाव <20 साई को ड्रॉप की अनुमति.
6. धीरे, पैकिंग सिस्टम जुदा, ऊपर से शुरू. जब अंत स्तंभ युग्मक 2 तक पहुँच जाता है, ध्यान से हटा दें. कुछ पैक सामग्री स्तंभ के ऊपर से extruding होना चाहिए. एक रेजर ब्लेड या इसी तरह की तेज धार के साथ, धीरे दूर extruding मोती पोंछ, कि स्तंभ के शीर्ष के साथ भी है एक मोती की सतह छोड़ने. मोतियों के लिए दबाव लागू मत जबकि यह कर रहा.
7. अंगूठी स्टैंड से पैक स्तंभ छुड़ाना. एक नया अंत युग्मक में एक नया मिलाना प्लेस और पैक स्तंभ मोड़ पर खुला (पूर्व) शीर्ष स्तंभ छोर पर युग्मक / मिलाना अंत के साथ इस कनेक्ट.
8. उचित स्तंभ लेबल. अब यह इस्तेमाल के लिए तैयार है. जब उपयोग में नहीं, स्तंभ पीबीएस में 0.02% 4 सोडियम azide ° सी के साथ संग्रहीत किया जा सकता है 6 महीने के लिए.

3) कार्यक्रम HPLC विधि

1. अपने HPLC प्रोग्रामिंग के विवरण निर्माता सॉफ्टवेयर की बारीकियों के अनुसार अलग अलग होंगे. हम एक Michrom प्रतिमान MG4 HPLC का उपयोग करें. इस मशीन पर, विधियों बनाया और स्क्रीन के शीर्ष पर "सेटअप" टैब के तहत पहुँचा. निम्न विधि का कार्यक्रम:
   

   समय	फ्लो दर (μl / मिनट)	%	% बी
   0:00	50	100	0
   9:00	50	100	0
   9:01	500	0	100
   13:50	500	0	100
   13:51	3000	100	0
   19:50	3000	100	0

   
   10 मिमी बफर Tris, 7.4 पीएच, 150 मिमी सोडियम क्लोराइड, 10 मिमी कैल्शियम क्लोराइड, 10 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड: एक बफर
   बफर बी 0.5 एम एसिटिक एसिड:
   यूवी डिटेक्टर 280 एनएम 0:00 से 19:50 करने के लिए पढ़ने के लिए क्रमादेशित किया जाना चाहिए. ए.यू. 50 - y-अक्ष कम absorbance के स्तर, उदाहरण के लिए, 0 का पता लगाने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
2. यदि एक autosampler कार्यक्रम है, उपलब्ध अंश संग्रह के लिए निम्नलिखित अनुसूची है. अन्यथा, हाथ से भिन्न जमा के रूप में संकेत दिया जब क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन.
   

   भाग	नमूना इंजेक्शन से संग्रह करने के लिए विलंब	संग्रह की अवधि (मिनट)
   प्रवाह के माध्यम से	2.8	4.1
   सीमित	9	2.6

) 4 HPLC के लिए नमूने की तैयारी

1. इस प्रोटोकॉल में उपयोग करने के लिए पहले, मानव प्लाज्मा 14 सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का उपयोग मार्स स्तंभ (सांता क्लारा, CA Agilent) के समाप्त किया जाना चाहिए. समाप्त प्लाज्मा, मानव लैक्टोफेरिन और खमीर invertase व्यक्तिगत trypsin से पचता है और desalted के रूप में पहले ¹ वर्णित चाहिए.
2. लेक्टिन विशेष लैक्टोफेरिन मानक तैयार करने के लिए, या तो AAL या SNA स्तंभ भाग 3 में विधि का उपयोग पर 50 स्नातकीय trypsin पचा लैक्टोफेरिन पर क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन. बाध्य अंश लेक्टिन विशेष लैक्टोफेरिन glycopeptides शामिल होंगे. भाग 6 के रूप में के रूप में 4.4 पार्ट में नमूने, और फीका बनाना बेअसर. 1 एमएल बफर ए में नमूना परिणामस्वरूप नमूना उपयोग के लिए तैयार है Resuspend.
3. तीन प्रयोगात्मक प्रदर्शन किया जाएगा प्रतिकृति. तीन के लिए नमूना तैयार करने के लिए प्रतिकृति, 30 μl मार्स समाप्त, trypsin पचा, प्लाज्मा समकक्ष (पीई) trypsin - पचा invertase 3 pmol और लेक्टिन विशिष्ट लैक्टोफेरिन (या तो AAL एलएसी या SNA-एलएसी) के एक μl जोड़ें. एक पीई non-processed/intact/original प्लाज्मा जिसमें से संसाधित प्लाज्मा (पच मार्स समाप्त और trypsin) की एक निश्चित राशि निकाली थी की मात्रा के रूप में परिभाषित किया गया है. नमूना बफर करने के लिए 330 μl के अंतिम मात्रा तक पहुँचने में जोड़ें.
4. बेअसर बफर (1 एम Tris पीएच 8.0) नमूना शीशियों कि eluate एकत्रित करेगा, जोड़ें. संख्या और शीशियों के साथ आप काम की मात्रा आपके autosampler की कमी पर निर्भर करेगा. MG4 प्रतिमान के लिए, एक शीशी एकत्र प्रवाह के माध्यम से और दो eluate इकट्ठा. यह लगभग 1.5 एमएल Tris बफर eluate के 1 एमएल बेअसर करने के लिए की आवश्यकता होगी. टारगेट निष्प्रभावी पीएच 7.0-8.0, पीएच सूचक कागज के साथ परीक्षण अंतिम पीएच.

5) क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन

1. सभी रिक्त और नमूना रन का पालन करें कि भाग 1 में वर्णित विधि का प्रयोग करेंगे. स्तंभ और buffers प्रयोग में है जबकि कमरे के तापमान पर हैं. स्तंभ 4 ° C पर संग्रहीत हैं, जबकि बफ़र्स कमरे के तापमान पर संग्रहित कर रहे हैं.
2. HPLC प्रणाली या तो AAL या SNA लेक्टिन स्तंभ संलग्न और दो रिक्त तरीकों (केवल बफर इंजेक्शन ए) चला. सुनिश्चित करें कि लेक्टिन स्तंभ लेक्टिन विशेष लैक्टोफेरिन (भाग 2) से मेल खाती है है.
3. तीन प्लाज्मा नमूनों chromatograph, 7 HPLC रन के कुल के लिए प्रत्येक इंजेक्शन नमूने के बीच में एक खाली, इंजेक्शन. रिक्त रन से Fractions एकत्र नहीं किया की जरूरत है.

6) फीका बनाना भिन्न एकत्र

प्रत्येक अंश इस प्रकार के रूप में एक 1 एमएल वाटर्स ओएसिस HLB SPE कारतूस का उपयोग करें:

1. वैक्यूम कई गुना करने के लिए आवश्यक कारतूस के संख्या संलग्न.
2. 1% चींटी एसिड में 1 एमएल 80% ACN है (20 lnHg कई गुना पर वैक्यूम गेज 5 पढ़ना चाहिए) के साथ प्रत्येक कारतूस गीले.
3. 1.5 एमएल 0.1% चींटी एसिड (20 lnHg कई गुना पर वैक्यूम गेज 5 पढ़ना चाहिए) के साथ कारतूस संतुलित करना
4. एक कारतूस (कई गुना पर वैक्यूम गेज 2 पढ़ना चाहिए - lnHg 2.5, और प्रवाह की दर 1 एमएल / मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए) पर एक नमूना की पूरी मात्रा लोड
5. 3 एक्स 1 एमएल 0.1% चींटी एसिड (20 lnHg कई गुना पर वैक्यूम गेज 5 पढ़ना चाहिए) के साथ कारतूस धो
6. Elute पेप्टाइड्स में / glycopeptides 1 एक्स 1 एमएल 0.1% चींटी एसिड में 80% acetonitrile के साथ लेबल Eppendorf ट्यूबों. (कई गुना पर वैक्यूम गेज 2 पढ़ना चाहिए - lnHg 2.5, और प्रवाह की दर 1 एमएल / मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए.) एक एकल संग्रह ट्यूब प्रत्येक कारतूस के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
7. प्रत्येक संग्रह ट्यूब के लिए 60 μl 0.5 एम अमोनियम बिकारबोनिट जोड़कर eluate बेअसर. लक्ष्य neutralized पीएच 7.0-8.0 है, परीक्षण पीएच सूचक कागज के साथ अंतिम पीएच.
8. उन्हें एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र पर ~ 2 35 @ सी. ° बजे के लिए (उदाहरण के लिए, एक थर्मो सावंत SpeedVac) चल रहा द्वारा eluted पेप्टाइड्स / ~~ 50 μL glycopeptides ध्यान

7) एफ पाचन PNGase

1. टेस्ट नमूना के लिए यह सुनिश्चित करने का पीएच 7.0 के बीच है - 8.0. यदि आवश्यक हो, 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट जोड़ने के लिए पीएच वृद्धि. यदि अंतिम नमूना मात्रा> 100 μl, speedvac नमूना है जब तक इसे 50-100 μl के बीच है.
2. प्रत्येक नमूना ट्यूब और सेते 37 ° रातोंरात सी 0.5 (250 यू) μl ग्लिसरॉल मुक्त PNGase एफ जोड़ें.

8) ज़िप युक्ति नमूने

1. PNGase एफ पचा नमूनों के साथ शुरू के रूप में प्रत्येक एक ziptip.
2. 10 μl 100% acetonitrile, 10 μl: 80% acetonitrile, 0.1% चींटी एसिड द्वारा पीछा के साथ गीले ziptip.
3. 20 μl 0.1% चींटी एसिड के साथ ziptip संतुलित करना.
4. Ziptip पर यह pipetting ऊपर और नीचे ziptip मैट्रिक्स के माध्यम से 10 गुना से नमूना लोड.
5. 10 μl 0.1% चींटी एसिड, 5 बार pipetting द्वारा ziptip धो लें.
6. 80% 10 μl acetonitrile, 0.1% चींटी एसिड के साथ एक साफ Eppendorf ट्यूब में नमूना Elute.
7. Elution दोहराएँ और एक ही ट्यूब में दूसरा 10 μl जोड़ने.
8. <2 μl की एक मात्रा के लिए नमूने Speedvac.
9. 20 μl 0.1% चींटी एसिड में Resuspend नमूने. नमूने अब कर रहे हैं LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण के लिए तैयार है.

9) प्रतिनिधि परिणाम:

20 मिलीग्राम / एमएल - POROS संयुग्मन 2 की रेंज में आम तौर पर पर मनका लेक्टिन सांद्रता पैदावार. यह आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के लिए इष्टतम है.

Trypsin पचा मार्स समाप्त मानव प्लाज्मा lectin क्रोमैटोग्राफी आम तौर पर बाध्य अंश में glycopeptides enriches. के रूप में glycopeptides PNGase LC-MS/MS के लिए पहले एफ इलाज कर रहे हैं, वे एन से जुड़े आम सहमति अनुक्रम के साथ पेप्टाइड्स के रूप में पहचाने जाते हैं, NXS / टी (जहां X किसी भी अवशेषों लेकिन प्रोलाइन है), जिसमें asparagine में बदला गया है PNGase एफ पेप्टाइड्स की क्रिया के माध्यम से इन विशेषताओं के साथ एक एसपारटिक एसिड deglycosylated पेप्टाइड्स (या "deglycopeptides") माना जाता है. औसत पर AAL या SNA क्रोमैटोग्राफी से अंश (एफटी) के माध्यम से प्रवाह 2-4% deglycopeptides होते हैं, जबकि बाध्य अंश में बरामद पेप्टाइड्स के 30-50% deglycopeptides हैं. आमतौर पर, एक QStar अभिजात वर्ग का उपयोग कर, 1000-1300 पेप्टाइड्स एफटी अंश में पहचाना जाएगा, और 200-400 पेप्टाइड्स बाध्य अंश में पहचाना जाएगा. दो या दो से अधिक अलग Invertase deglycopeptides एफटी अंश और बाध्य अंश (1 टेबल) में दो या दो से अधिक अलग लैक्टोफेरिन deglycopeptides में मनाया जाना चाहिए.

तालिका 1.

Discussion

इस प्रोटोकॉल glycan विशिष्ट तरीके में glycopeptides अलग और पहचान के लिए एक त्वरित तरीका प्रदान करता है. के रूप में ग्लाइकोसिलेशन विकास और रोगजनन के दौरान विशेष रूप से एक जीव के भीतर बड़े पैमाने पर बदलता है, इस तकनीक को सवालों की एक विस्तृत विविधता का पता करने के लिए लागू हो सकता है. विशेष रूप में, हम विधि का उपयोग कर रहे हैं करने के लिए चुनिंदा glycopeptides कि biomarker खोज की दिशा में एक पहला कदम के रूप में कैंसर से जुड़े epitopes के साथ संशोधित किया गया है समृद्ध.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human plasma			We make this in house
Human lactoferrin	Sigma-Aldrich	L0520	Trypsin-digest before use
Yeast invertase	Sigma-Aldrich	I0408	Trypsin-digest before use
Oass HLB SPE cartridges	Waters	WAT094225	1 cc volume
ZipTip pipet tips	Fisher Scientific	ZTC1 8M0 96	Millipore, C18 for 10 ml pipette
Tris	Fisher Scientific	BP154-1	99%
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	A6141	99%
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C4901	96%
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266	98%
Acetic acid	Sigma-Aldrich	242853	99.7%
pH indicator paper	Fisher Scientific	M95903	Range 0-14
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998	99.9%
Formic acid	Pierce, Thermo Scientific	28905	99%
Phosphate-buffered saline	Invitrogen	14190-136	Without calcium and magnesium
Sodium azide	Sigma-Aldrich	71289	99.5%
PNGase F	New England Biolabs	P0705L	Glycerol-free
Vacuum-filter flasks	Fisher Scientific	SCGVU05RE	0.2 mm pores
POROS-AL beads	Applied Biosystems	1-6028-02
Aleuria aurantia lectin	Vector Laboratories	L-1390
Sambucus nigra agglutinin	Vector Laboratories	L-1300
Sodium cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	296945	5.0 M solution