Summary
Dieses Video-Artikel beschreibt Schritt für Schritt, wie man eine Samenprobe Prozess zu einer qualitativ hochwertigen Fluoreszenz zu erreichen
Abstract
Aneuploidien sind die häufigsten Chromosomenstörungen beim Menschen. Die meisten dieser Veränderungen ergeben sich aus meiotischen Fehler bei der gametogenic Prozess bei den Eltern. In der menschlichen Männchen, können diese Fehler auf die Produktion von Spermien mit numerischen Chromosomenanomalien, die eine erhöhte Gefahr der Übertragung dieser Anomalien auf die Nachkommen vertreten führen.
Aus diesem Grund hat die Technik der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) auf Spermakerne zu einem Protokoll weithin im Zusammenhang mit der klinischen Diagnose integriert. Diese Praxis liefert eine Schätzung der Frequenzen von numerischen Chromosomenanomalien in den Keimzellen der Patienten, die zur genetischen Reproduktion Rat zu suchen.
Bis heute sind die Chromosomen am häufigsten in Spermien FISH Analyse mit einbezogen Chromosomen X, Y, 13, 18 und 21.
Dieses Video-Artikel beschreibt Schritt für Schritt, wie zu verarbeiten und zu befestigen ein menschliches Sperma Probe, wie man decondense und denaturieren die Spermien Chromatin, wie es weitergehen soll, um Spermien FISH Präparate zu erhalten, und wie die Ergebnisse am Mikroskop sichtbar zu machen. Besondere Hinweise über die wichtigsten Schritte gegeben werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
Protocol
I. Aufbereitung der Probe und Zellfixierung
- Verlassen Sie die Samenprobe in sterilen Behältern bei Raumtemperatur für 20 Minuten, bis Verflüssigung.
- Übertragen Sie die Probe in ein Zentrifugenröhrchen und spinnen sie bei 1000g für 5 Minuten.
- Entfernen Sie vorsichtig und den Überstand verwerfen mit einer Pasteurpipette.
- Add hypotonischen Lösung (KCl, 0,075 M) vorgewärmt auf 37 ° C, Tropfen für Tropfen, beim Mischen auf einem Vortex auf ein Endvolumen von 10 ml zu erhalten.
- Das Röhrchen wird in ein Wasserbad bei 37 ° C für 30 Minuten.
- Zentrifugation bei 1000g für 5 Minuten. Vorsichtig den Überstand verwerfen durch Dekantieren, ohne das Pellet.
- Nach Resuspendieren des Pellets, fügen Sie frisch zubereitete Carnoy Fixativ (3:1 Methanol: Essigsäure) tropfenweise unter Mischen auf einem Vortex auf ein Endvolumen von 8 ml zu erhalten.
- Wiederholen Sie die Punkte 6 und 7 so oft wie notwendig, um ein weißes Pellet zu erhalten.
- Fügen Sie frisch zubereitete Methanol: Essigsäure (3:1) tropfenweise auf das Endvolumen auf die zelluläre Konzentration für den Erhalt von guten Zellausbreitung (in diesen Fällen mit einem kleinen Pellets erforderlich einstellen, werden nur wenige Tropfen genügen, wohingegen Proben mit einem hohen Anteil von Spermien erholt, kann das Endvolumen erreicht 1-2 ml). Ein Test gleiten kann, indem er die resuspendierten Probe auf eine ungefettete Rutsche und prüft es unter einem Phasenkontrast-Mikroskop vorgenommen werden. Auf diese Weise können die zelluläre Dispersion überprüfen und würde es korrigieren, wenn es notwendig ist, in weiteren Dias.
- Um die Erweiterungen, fallen aus einer Höhe von mindestens 40 cm zwei oder drei Tropfen der Zellsuspension in die Mitte des unfrosted Dias (zuvor in Methanol bei -20 ° C gelagert, um sie zu entfetten). Machen So aktivieren Sie den Ort der Probe in das Protokoll, markieren Sie den Bereich mit den Spermien-Erweiterung auf der gegenüberliegenden Seite der Folie mit einem Diamant-Bleistift.
- Bewahren Sie die Objektträger bei -20 ° C für mindestens 24 Stunden.
Hinweis: Die Zugabe von Methanol: Essigsäure (3:1) tropfenweise unter Mischen ist ein sehr wichtiger Schritt, um die Bildung von Spermien Aggregate zu vermeiden.
II. Dekondensation
- Die Objektträger bei -20 ° C gelagert muss abgetaut, um mit dem Protokoll fortgesetzt werden (lassen Sie sie bei Raumtemperatur).
- Legen Sie die Folie in zwei aufeinander folgenden Färbetrog mit 2x Kochsalzlösung-Natriumcitrat-Lösung (2 × SSC) für jeweils 3 Minuten.
- Die Objektträger durch eine Reihe von Ethanol wäscht für 2 Minuten in jede Coplin Glas. Beginnen Sie mit 70% Ethanol, folgen um 90% und endet mit 100%. Dry die Rutsche verlassen Sie es bei Raumtemperatur.
- Inkubieren Sie die Folie in Dithiothreitol-Lösung (1,4-Dithiothreitol 5mm, 1% Triton X-100, 2-Amino-2-(hydroxymethyl) -1,3-propandiol 50 mM) bei 37 ° C in den Brutschrank, um das Chromatin decondense. Dieses Produkt wirkt durch Aufbrechen der Disulfidbrücken der Protamine, dass die Spule der DNA in den Spermien Zellkern. Dies ist ein sehr wichtiger Schritt, weil die DNA in den Spermien Zellkern stark verdichtet wird. Die Inkubationszeit der Folien in Dithiothreitol-Lösung (DTT) muss nach dem Muster der Reaktivität zu diesem Artikel eingestellt werden. Normalerweise ist diese Zeit ca. 8 Minuten, obwohl es 2 bis 15 Minuten variieren.
- Unmittelbar, übertragen Sie die Folie an zwei aufeinander folgenden Färbetrog mit 2 × SSC für 3 Minuten in jeder Coplin.
- Weiter, indem die Folie durch eine Reihe von Ethanol wäscht für 2 Minuten in jede Coplin Glas (70%, 90% und 100% Ethanol). Lassen Sie die Folie trocken bei Raumtemperatur.
Hinweis: Übermäßige DTT wäre in disperser FISH-Signale am Ende des Verfahrens führen, während eine zu kurze Belichtung in einem Mangel an bestimmten Signalen führen würde.
III. Hybridisierung
- Denaturieren Spermien-DNA durch Inkubation der Folie in einer Coplin Glas mit Formamid-Lösung (70% Formamide/2xSSC) bei 73 ° C für 5 Minuten.
- Die Objektträger durch Ethanol-Lösungen für 1 Minute pro Coplin jar (Beginn mit 70% Ethanol, 85% und Finish mit 100%). Lassen Sie die Folie trocken bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie direkt 5 l des entsprechenden ready-to-use-Sonde Mischung zu einem 15x15 Deckglas (AneuVysion Assay Multi-Farb-Probe Panel: CEP 18/X/Y oder LSI 13/21).
- Wie es in dem Video zu sehen ist, legen Sie vorsichtig die Folie auf das Deckglas, um gemeinsam das Zielgebiet und die Sonde Mischung. Seal es mit Gummi-Zement.
- Legen Sie die Folie in einen vorgewärmten 37 ° C Hybridisierung Kammer (HYBrite ™) und inkubieren bei 37 ° C für 6-24 Stunden.
Hinweis: Während der Denaturierung der Spermaprobe ist zwingend erforderlich, die Notwendigkeit der Denaturierung der Sonden wird vom Hersteller bestimmt. Die Sonde Mischungen im Sinne dieses Protokolls sind gebrauchsfertig und in diesem Fall Sonde Denaturierung ist nicht erforderlich.
Das Volumen der Sonde Mischung wird je nach Größe der hybridisierten Bereich variieren.
IV. WäschtPost-Hybridisierung
- Nehmen Sie die Folie aus der Hybridisierung Kammer.
- Entfernen Sie die Gummi-Zement und vorsichtig das Deckglas Schiebetüren sanft zur Seite.
- Zur Beseitigung der unspezifischen Hybridisierungssignale Ort der Schieber für 2 Minuten in einem Coplin Glas mit 0.4xSSC/0.3% NP-40 vorgewärmt auf 73 ° C in einem Wasserbad.
- Übertragen Sie die Folie an eine 2xSSC/0.1% NP-40-Waschlösung bei Raumtemperatur für 1 Minute. Lassen Sie die Folie trocken bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie eine Gegenfärbung Produkt der Zielregion (8 l für ein 18x18 Deckglas). Die häufigste Produkt verwendet wird 4 ',6-Diamino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc.).
- Wie es in dem Video zu sehen ist, decken die hybridisierte Region mit einem Deckglas (die Hybridisierung des Deckglases mit Nagellack versiegelt werden können erhalten).
- Shop hybridisierten Objektträger bei -20 ° C im Dunkeln, bis ihre Aussicht Analyse. Unter diesen Bedingungen die Folien können bis zu 12 Monate ohne in Fluoreszenzsignalintensität signifikante verloren gespeichert werden.
Hinweis: Eine höhere Temperatur oder eine übermäßige Waschzeit kann bei der Beseitigung von einigen Signalen führen, während das Gegenteil nicht waschen würde aus unspezifischen Sonde Hybridisierungen.
Das Volumen der Gegenfärbung Produkt zugesetzt werden nach der Größe der Hybridisierung Bereich zur Deckung variieren.
V. Visualisierung
Die Präparate können unter einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem Triple-Band-Filter für DAPI / Texas Red / FITC und Single-Band-Filter für Aqua, FITC und Texas Red ausgestattet ausgewertet werden. Standard-Bewertungskriterien muss für die korrekte Auswertung der Spermakerne 1 gefolgt werden.
Die Vorbereitung mit Sonden für die Chromosomen X, Y und 18 hybridisiert sollten Signale für diese drei Chromosomen-Display. Jeder normale Spermien müssen zeigen eine blaue Signal (entspricht dem Chromosom 18) und ein grünes Signal (X-tragenden Spermien) oder ein rotes Signal (Y-Spermien).
In der Vorbereitung mit Sonden für die Chromosomen 13 und 21, ein grünes Signal für das Chromosom 13 und ein rotes Signal für Chromosom 21 hybridisiert sollte in jedem normalen Spermien unterschieden werden.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie die menschliche Samenproben für den Erhalt von Spermien FISH Präparate Prozess. Mit diesem Protokoll ist es möglich, chromosomale Anomalien bei männlichen Keimzellen zu analysieren. Spermatozoen Aneuploidietestung hat Anwendungen entweder im Rahmen der Grundlagenforschung und in der reproduktiven Beratung der unfruchtbaren Männer. Obwohl in der klinischen Diagnostik der am häufigsten untersuchten Chromosomen X, Y, 13, 18 und 21, andere kommerzielle Sonden für eine breite Palette von Chromosomen und loci sind verfügbar und können auch in diesen Experimenten verwendet werden.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437) unterstützt. Die Autoren danken J. Blanco und F. Vidal für ihre Überwachung und Ermutigung, und J. Lucas für seine technische Unterstützung.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche Group | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
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Material | Vysis Inc. | 32-161075
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| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Cover slips (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche Group | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus Instruments | ||
| Methanol | Material | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus Corporation | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Instruments | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
References
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
