Summary
Nous décrivons une méthode rapide et efficace pour la purification des mitochondries de la levure
Abstract
Les mitochondries sont le site principal de production d'ATP au cours du métabolisme aérobie dans eucaryotes non photosynthétiques cellules
Protocol
Matériel et méthodes
Les souches de levures et de conditions de croissance
La souche de type sauvage BY4742 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) a été cultivé en milieu riche YEPD (extrait de levure 1%, 2% de peptone, glucose 2%). Les cellules ont été cultivées à 30 ° C avec rotation agitation à 200 rpm dans des erlenmeyers à un "flacon de volume / moyen volume" ratio de 5:1.
Isolement de la fraction mitochondriale brut
- Cultivez 1 L de la culture souche sauvage BY4742 pendant 48 h.
- Verser la culture dans 500 ml tubes à centrifuger Nalgene. Équilibrer la charge et les cellules de récolte par centrifugation pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante.
- Décanter le surnageant et remettre les cellules granulées dans 250 ml d'dH2O. Cellules par centrifugation pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante.
- Décanter le surnageant et remettre les cellules granulées dans 250 ml d'dH2O. Cellules par centrifugation pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante.
- Déterminer le poids humide de culot cellulaire.
- Resuspendre culot cellulaire dans un tampon de la TNT [2 ml de tampon / g (poids humide) de cellules].
- Transférer la suspension cellulaire à tubes de 50 ml en plastique Falcon.
- Tournez les tubes à 70 rpm dans un shaker pendant 20 min à 30 ° C.
- Récolte des cellules par centrifugation pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante.
- Resuspendre culot cellulaire dans un tampon de Zymolyase sans Zymolyase [7 ml de tampon / g (poids humide) de cellules].
- Cellules par centrifugation pendant 5 min à 3000 xg à température ambiante.
- Resuspendre culot cellulaire dans un tampon de Zymolyase sans Zymolyase [7 ml de tampon / g (poids humide) de cellules].
- Transfert suspension cellulaire dans un flacon en verre.
- Ajouter la poudre de Zymolyase-100T [1 mg de Zymolyase-100T / g (poids humide) de cellules] à la suspension cellulaire.
- Tournez la fiole avec la suspension cellulaire à 70 rpm dans un shaker pendant 30 min à 30 ° C.
- Sphéroplastes Transfert formé en raison de la digestion de la paroi cellulaire avec Zymolyase-100T à 50 ml tubes à centrifuger en plastique.
- Pellet sphéroplastes par centrifugation pendant 8 min à 2200 xg à 4 ° C.
** Toutes les étapes ultérieures doivent être effectuées à 4 ° C ou sur glace. Suspensions de sphéroplastes doit être manipulé avec soin en utilisant des pipettes avec des conseils coupé pour éviter de casser les organelles .**
- Resuspendre sphéroplastes granulés de tampon d'homogénéisation glacée [6,5 ml de tampon / g (poids humide) de cellules].
- Pellet sphéroplastes par centrifugation pendant 8 min à 2200 xg à 4 ° C.
- Resuspendre sphéroplastes granulés de tampon d'homogénéisation glacée [6,5 ml de tampon / g (poids humide) de cellules].
- Transfert des cellules à un pré-refroidis sur la glace de verre homogénéisateur.
- En utilisant un pilon serré, homogénéiser les cellules en faisant 15 coups de pilon.
- Ajouter 1 volume de tampon d'homogénéisation glacée.
- Transfert sphéroplastes homogénéisé à 50 ml tubes à centrifuger en plastique.
- Pellet cellules ininterrompue, les noyaux, et les gros débris par centrifugation pendant 5 min à 1500 xg à 4 ° C.
- Centrifuger le surnageant résultant pendant 5 min à 3000 xg à 4 ° C.
- Centrifuger le surnageant résultant pendant 15 min à 12000 xg à 4 ° C.
- Décanter le surnageant et remettre le culot dans glacée tampon d'homogénéisation [6,5 ml de tampon / g (poids humide) de cellules].
- Centrifuger pendant 5 min à 3000 xg à 4 ° C.
- Centrifuger le surnageant résultant pendant 15 min à 12000 xg à 4 ° C.
- Décanter le surnageant et remettre le culot dans 3 ml de tampon glacé SEM.
** Bien que cette suspension est enrichi dans les mitochondries, il contient également d'autres organites tels que le réticulum endoplasmique (microsomes), Golgi, et de vacuoles. Pour obtenir des mitochondries pur, cette fraction grossière mitochondriale peut être soumis à un fractionnement supplémentaire, comme décrit ci-dessous .**
Purification des mitochondries dépourvue de contamination par d'autres organites
- Placer 1,5 ml de glace-froid 60% (p / v) de saccharose dans EM tampon dans un tube à centrifuger Beckman Ultra-Clear.
- Superposition de 60% (p / v) de saccharose avec 4 ml de 32%, 1,5 ml de 23%, 1,5 ml de saccharose à 15% (tous les tampons p / v dans EM).
- Placer 3 ml de la fraction grossière des mitochondries dans les SEM de tampon au-dessus de 15% (p / v) de saccharose.
- Centrifugeuse Beckman SW41 dans un Ti-balancer Rotor pendant 1 h à 134 000 xg (33 000 rpm) à 4 ° C.
- La forme intacte mitochondries une bande brune au 60% / interface de saccharose 32%.
- Retirer délicatement le saccharose jusqu'à atteindre la bande mitochondriale.
- Retirez la bande mitochondriale aide d'une pipette avec une pointe de coupe et le placer dans un tube de centrifugeuse Beckman pour un MLS-5 du rotor.
- Remplir le tube avec un tampon de SEM.
- Pellet les mitochondries pur par centrifugation dans un rotor MLS-5 pendant 30 min à 10000 xg (31 000 tpm) pendant 30 minutes à 4 ° C.
- Décanter le surnageant à l'aided'une pipette.
- Utilisez les mitochondries purs pour l'analyse des fonctions mitochondriales, mitochondriale protéome et lipidome, et l'ADN mitochondrial.
Réactifs
- DTT [100 mm Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM de dithiothréitol] (pour 15 ml)
- 1,5 ml de 1 M Tris/H2SO4 tampon (pH 9,4)
- 150 pi de 1 M de DTT
- Volume à 15 ml
- Buffer Zymolyase [20 mM de phosphate de potassium (pH 7,4), 1,2 M de sorbitol] (pour 100 ml)
- 2 ml de 1 M de tampon phosphate de potassium (pH 7,4)
- 60 ml de 2 M de sorbitol
- Volume à 100 ml
- Tampon d'homogénéisation [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M de sorbitol, EDTA 1 mM, 0,2% (p / v) de BSA] (pour 250 ml]
- 2,5 ml de 1 M Tris / HCl (pH 7,4)
- 75 ml de 2 M de sorbitol
- 500 ul d'EDTA 500 mM
- 0,5 g de BSA
- Volume de 250 ml
- SEM tampon [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM de saccharose, 1 mM EDTA] (pour 250 ml)
- 2,5 ml de MOPS M 1 / KOH (pH 7,2)
- 31,25 ml de 2 M de saccharose
- 500 ul d'EDTA 500 mM
- Volume de 250 ml
- EM tampon [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), EDTA 1 mM] (pour 250 ml)
- 2,5 ml de MOPS M 1 / KOH (pH 7,2)
- 500 ul d'EDTA 500 mM
- Volume de 250 ml
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Discussion
Cette méthode permet l'isolement à haut rendement des mitochondries pur à partir de cellules de levure. Les mitochondries purifiées par cette méthode sont essentiellement libres de contamination par d'autres organites et conservent leur intégrité structurale et fonctionnelle après leur purification. Les rendements méthode décrite mitochondries qui sont adaptés à la cellule sans reconstitution des processus essentiels mitochondriale. Ces mitochondries très purs peuvent aussi être utilisées pour l'analyse de la structure et les fonctions mitochondriales, mitochondriale protéome et lipidome, et l'ADN mitochondrial.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions des IRSC et le CRSNG du Canada. VIT est une nouvelle chercheuse des IRSC et président de Concordia recherche universitaire en génomique, biologie cellulaire et le vieillissement.
References
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- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &, Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).
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