Summary
Vi beskriver en snabb och effektiv metod för rening av mitokondrier från jästen
Abstract
Mitokondrierna är den största anläggningen av ATP produktion under aerob metabolism i eukaryota icke-fotosyntetiserande celler
Protocol
Material och metoder
Jäststammar och villkor tillväxt
Den vildtyp stam BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) odlades i rika YEPD medelhög (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos). Cellerna odlades vid 30 ° C med roterande skaka vid 200 rpm i E-kolvar på en "kolv volym / medelhög volym" förhållandet 5:1.
Isolering av råolja mitokondriella fraktionen
- Odla ett L i vildtyp stam BY4742 kultur för 48 h.
- Häll kultur i 500 ml Nalgene centrifugrör. Balansera belastningen och celler skörd genom centrifugering i 5 min vid 3000 xg vid rumstemperatur.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleterat celler i 250 ml dH2O. Pellets cellerna genom centrifugering under 5 min vid 3000 xg vid rumstemperatur.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleterat celler i 250 ml dH2O. Pellets cellerna genom centrifugering under 5 min vid 3000 xg vid rumstemperatur.
- Bestäm våtvikt av cellpelleten.
- Resuspendera pelleterat cellerna i DTT buffert [2 ml buffert / g (våtvikt) celler].
- Överför cellsuspension till 50 ml Falcon plaströr.
- Rotera rören vid 70 rpm i en shaker i 20 minuter vid 30 ° C.
- Harvest cellerna genom centrifugering i 5 min vid 3000 xg vid rumstemperatur.
- Resuspendera pelleterat cellerna i Zymolyase buffert utan Zymolyase [7 ml buffert / g (våtvikt) celler].
- Pellets celler genom centrifugering i 5 min vid 3000 xg vid rumstemperatur.
- Resuspendera pelleterat cellerna i Zymolyase buffert utan Zymolyase [7 ml buffert / g (våtvikt) celler].
- Överföring cellsuspension till en glaskolv.
- Tillsätt pulver av Zymolyase-100T [1 mg Zymolyase-100T / g (våtvikt) celler] till cellsuspension.
- Vrid kolven med cellsuspension vid 70 rpm i en shaker i 30 minuter vid 30 ° C.
- Överför spheroplasts bildas på grund av nedbrytning av cell med Zymolyase-100T till 50-ml rör av plast centrifugen.
- Pellets spheroplasts genom centrifugering för 8 min vid 2200 xg vid 4 ° C.
** Alla efterföljande steg ska utföras vid 4 ° C eller på is. Suspensioner av spheroplasts ska hanteras varsamt med hjälp av pipetter med cut tips för att undvika att bryta organeller .**
- Resuspendera pelleterat spheroplasts i iskallt homogenisering buffert [6,5 ml buffert / g (våtvikt) celler].
- Pellets spheroplasts genom centrifugering i 8 minuter vid 2200 xg vid 4 ° C.
- Resuspendera pelleterat spheroplasts i iskallt homogenisering buffert [6,5 ml buffert / g (våtvikt) celler].
- Överför celler till ett i förväg kylt på is glas homogeniseringsblandare.
- Med hjälp av en stram mortelstöt, homogenisera de celler genom att göra 15 slag i mortelstöt.
- Tillsätt 1 volym iskall homogenisering buffert.
- Överföring homogeniserade spheroplasts till 50-ml rör av plast centrifugen.
- Pellets obruten celler, kärnor och stora skräp genom att centrifugera i 5 minuter vid 1500 xg vid 4 ° C.
- Centrifugera den resulterande supernatanten i 5 minuter vid 3000 xg vid 4 ° C.
- Centrifugera den resulterande supernatanten i 15 min vid 12 tusen xg vid 4 ° C.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i iskallt homogenisering buffert [6,5 ml buffert / g (våtvikt) celler].
- Centrifugera i 5 min vid 3000 xgi vid 4 ° C.
- Centrifugera den resulterande supernatanten i 15 min vid 12 tusen xg vid 4 ° C.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i 3 ml iskall SEM buffert.
** Även denna suspension anrikas i mitokondrierna, det innehåller också andra organeller såsom det endoplasmatiska retiklet (mikrosomer), Golgi och vakuoler. För att få rena mitokondrier, kan denna grova mitokondriella fraktionen genomgå ytterligare fraktionering, som beskrivs nedan .**
Rening av mitokondrier saknar för kontamination av andra organeller
- Placera 1,5 ml iskall 60% (w / v) sackaros i EM bufferten i en Beckman Ultra Clear centrifugrör.
- Overlay 60% (w / v) sackaros med 4 ml 32%, 1,5 ml av 23%, 1,5 ml av 15% sackaros (alla WT / v i EM buffert).
- Plats 3 ml av den råa mitokondriella fraktionen i SEM buffert ovanpå 15% (w / v) sackaros.
- Centrifugera i en Beckman SW41 Ti svängande-hink rotor för 1 h vid 134 tusen xg (33 tusen rpm) vid 4 ° C.
- Den intakta mitokondrierna bildar ett brunt band på 60% / 32% sackaros gränssnitt.
- Ta försiktigt bort sackaros tills de når mitokondriella bandet.
- Ta bort den mitokondriella band med hjälp av en pipett med en cut spets och placera den i en Beckman centrifugrör för en MLS-5 rotorn.
- Fyll röret med SEM buffert.
- Pellets den rena mitokondrier genom centrifugering i en MLS-5 rotor för 30 minuter på 10000 xg (31 tusen rpm) i 30 minuter vid 4 ° C.
- Dekantera supernatanten med hjälp aven pipett.
- Använd rena mitokondrier för analys av mitokondrie-funktioner, mitokondrie Proteome och lipidome, och mitokondrie-DNA.
Reagenser
- DTT buffert [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mm ditiotreitol] (för 15 ml)
- 1,5 ml 1 M Tris/H2SO4 buffert (pH 9,4)
- 150 l 1 M DTT
- Volym 15 ml
- Zymolyase buffert [20 mM kaliumfosfat (pH 7,4), 1,2 m sorbitol] (för 100 ml)
- 2 ml 1 M kalium fosfatbuffert (pH 7,4)
- 60 ml 2 M sorbitol
- Volymen till 100 ml
- Homogenisering buffert [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 m sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w / v) BSA] (för 250 ml]
- 2,5 ml 1 M Tris / HCl buffert (pH 7,4)
- 75 ml 2 M sorbitol
- 500 l av 500 mM EDTA
- 0,5 g BSA
- Volym till 250 ml
- SEM buffert [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mm sackaros, 1 mM EDTA] (för 250 ml)
- 2,5 ml 1 M MOPS / Koh buffert (pH 7,2)
- 31,25 ml 2 M sackaros
- 500 l av 500 mM EDTA
- Volym till 250 ml
- EM buffert [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (för 250 ml)
- 2,5 ml 1 M MOPS / Koh buffert (pH 7,2)
- 500 l av 500 mM EDTA
- Volym till 250 ml
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod gör att den högavkastande isolering av rena mitokondrier från jästceller. Mitokondrier renas genom denna metod är i huvudsak fri från föroreningar av andra organeller och behålla sina strukturella och funktionella integritet efter rening. Den beskrivna metoden ger mitokondrier som är lämpliga för cellfria beredning av viktiga mitokondriella processer. Dessa mycket rena mitokondrier kan också användas för analys av mitokondrie-struktur och funktioner, mitokondrie Proteome och lipidome, och mitokondrie-DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från CIHR och NSERC av Kanada. VIT är en CIHR ny undersökare och Concordia University forskning ordförande i genomik, cellbiologi och åldrande.
References
- Voet, D., Voet, J. G. Biochemistry. , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).
- Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &, Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).
- Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120, 483-495 (2005).
