Summary
نحن هنا وصف بروتوكول الأساسية لوصفها الفلورسنت من عناصر مختلفة من الأنابيب القلب من اليرقة وتعليم الكبار
Abstract
و
Protocol
قبل أن تبدأ
- إعداد الحلول التالية :
- الاسترخاء العازلة (ذبابة الفاكهة الاصطناعي الدملمف (ADH) (انظر "تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة") الذي يحتوي على 10 EGTA ملم)
- تثبيتي (4 ٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني 1X)
- PBSTx (PBS تحتوي على 0.1 ٪ تريتون - X - 100)
- المخفف مناسب الابتدائية والأنواع المحددة الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى في PBSTx
- تشريح ذبابة الفاكهة لفضح أنابيب القلب (من الذباب الكبار و / أو اليرقات) التالي
- ذبابة الفاكهة في قلب شبه سليمة في إعداد بروتوكول "تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة" ، أو
- استخدام الاوكسيجين ADH أثناء تشريح اليرقات وتهجير دبوس الخلفي قليلا من المنتصف بطني : ذبابة الفاكهة تشريح NMJ اليرقات بروتوكول 1 مع التعديلات التالية. يتم قطع اليرقات على طول خط الوسط البطني. لا تقم بإزالة أي نوع من الأنسجة قبل التثبيت.
تلوين تألقي
- تأكد من أن كل القلوب هي ضرب إيقاعي في ADH الاوكسيجين. استبدال بسرعة ADH مع الاسترخاء العازلة. فحص كل أنبوب القلب لضمان تحول دون انكماش.
- إصلاح القلوب بالاستعاضة عن العازلة الاسترخاء مع مثبت. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة مع اهتزاز لطيف. (للحصول على هز إعداد اليرقات ليس من الضروري في أي خطوة ، ويمكن اعتبار تضر سلامة نسيج القلب).
- غسل العينات ثلاث مرات لمدة عشر دقائق مع PBSTx في درجة حرارة الغرفة مع الهز المستمر.
- بالنسبة للبالغين ، وتقليم مرة أخرى بعناية حواف البطني للبشرة البطن مثل هذا أن ما تبقى هو أكثر بيضاوي الشكل وتقريبه أقل. بالإضافة إلى ذلك ، مع خفض واحدة بين البطن والصدر ، بعناية ونظافة الجسم شرائح منفصلة على حد سواء ، وضمان الحد الأدنى من الضرر على المنطقة الأمامية من القلب. لقلوب اليرقات ، وإزالة الدهون في الجسم بعناية باستخدام ملقط الغرامة. يجب أن يتم تنفيذ إزالة الدهون بحذر شديد ، لأن القلب لا يزال هشا اليرقات خاصة وتحظى بتأييد كبير جدا من العضلات أو غيرها من النسيج الضام. لا تقم بإزالة فروع القصبة الهوائية وهذا قد يؤدي إلى تلف القلب.
- نقل المنطقة الظهرية قلصت من بشرة البطن من الحواف ، وتجنب الاتصال مع أنبوب القلب موقعا مركزيا ، في 96 لوحة جيدا مع الآبار التي تحتوي على 5-10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة في PBSTx. المكان لا يزيد على 12 عينة لكل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة مع التحريض المستمر. ويمكن أيضا أن يتم بين عشية وضحاها حضانة في 4 درجات مئوية.
- إزالة الابتدائي حل الأضداد. غسل قلوب ثلاث مرات لمدة عشر دقائق مع 100 ميكرولتر PBSTx في درجة حرارة الغرفة مع الهز المستمر.
- بعد إزالة العازلة غسل النهائي ، إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية في PBSTx ، على أن تستكمل مع Alexa594 - phalloidin (1:1000). احتضان لمدة ساعة مع الهز المستمر في درجة حرارة الغرفة. الاحتفاظ بعينات مغطاة لمنع fluorophore التبييض.
- التالية حضانة الثانوية ، وغسل قلوب ثلاث مرات لمدة عشر دقائق مع 100 ميكرولتر من PBSTx في درجة حرارة الغرفة مع الهز المستمر. الحفاظ على عينات غطت جميع أنحاء خطوات الغسيل.
- لإزالة تريتون 100 - X ، شطف قلوب مرة أخيرة في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. ويمكن تخزين العينات في الظلام في 4 درجات مئوية لعدة أيام قبل التركيب.
تصاعد لهارتس الكبار
- يلتزم كل منهما 18 X 18 مم غطاء ينزلق إلى شريحة المجهر مع 10 ميكرولتر من Vectashield المتوسطة المتزايدة. وينبغي متباعدة في coverslips ~ 10-15 ملم إربا. وضع قطرة صغيرة الثالث من تصاعد في والمتوسطة بين coverslips اثنين.
- مكان ميكرولتر من 20 Vectashield في وسط ساترة الثالثة.
- إزالة بعناية كل من قلوب من محلول الغسيل PBS من الحواف الشديد للبشرة ، وبلطف مكان لهم للقلب الجانب السلبي على انخفاض المتوسط متزايدة على ساترة الثالثة. مكان لا يزيد عن خمس قلوب كل قطرة ماء على ساترة.
- الاختيار تحت المجهر للتأكد من كل قلوبهم لأسفل.
- عكس بعناية ساترة تحتوي على قلوب والمكان بسرعة على الشريحة التي تحتوي على زوج من coverslips بحيث الحبرية بصمامات القلب أنابيب مع قطيرة Vectashield بين الزوج ساترة. ينبغي تشكيل "جسر" من قبل coverslips. وسيتم تعليق قلوب ساترة وبين الشريحة المجهر.
- الاختيار تحت المجهر للتأكد من أن قلوب تواجه الآن التصاعدي.
- الإصلاح coverslips في حوافها مع طلاء الأظافر.
- قلوب هي الآن جاهزة للتصوير المجهري الفلورسنت أو عبر مبائر.
معشوقة = "jove_title"> تركيب لهارتس اليرقات
- وضع قطرة (~ 20 ميكرولتر) Vectashield على شريحة المجهر.
- نقل بدقة تصل إلى عينتين اليرقات الى الجانب لهم وتوجيه Vectashield الظهرية أسفل باستخدام الإبر التنغستن.
- سحب العينات بشكل فردي بعيدا عن تصاعد المتوسطة وربط كل وبالتوازي.
- مكان ساترة على طرفي نقيض من العينة. باستخدام الملقط ، وضع ساترة الثالث على أعلى ، أول من زرع جانب واحد على ساترة الخلفي وخفضه وصولا الى ساترة الأمامي وبالتالي تشكيل جسر. وستقوم قوات الشعرية يسبب تدفق Vectashield الخلفي من لالأمامية والتي تساعد المحاذاة الصحيحة للقلب اليرقات.
- إصلاح كافة coverslips في مكان ، في حوافها ، مع طلاء الأظافر بعناية وملء الفراغ بين 20-30 coverslips مع Vectashield ميكرولتر.
- الختم مع طلاء الأظافر وتخزينها في 4 درجات مئوية ، أو للتخزين الطويل الأجل في -20 درجة مئوية.
ممثل النتائج
عندما أعدم بشكل صحيح ، وينبغي لجميع مكونات والأنسجة المرتبطة السفينة الظهرية تبقى سليمة ويمكن تصور بسهولة. ينبغي أن يكون الحد الأدنى مضان الخلفية. بالنسبة للبالغين ، وطبقة العضلات البطنية الطولي البقع بشكل جيد للغاية ويعطي إشارة كبيرة (الشكل 1 والشكل 2). والعضلية الدائرية الأساسية ومع ذلك ، لا تميل الى انتاج ما يشير الى كثافة كما ان من الطبقة الفوقية البطني. وmyocytes من "غرفة المخروطية" الأمامي للقلب الكبار تحتوي على كمية كبيرة من المواد مقلص ، وبالتالي ، فإن هذه المنطقة كما يبدو النسبي الأكثر قوة في التعامل مع ما تبقى من أنبوب القلب. قلب اليرقات يبين ترتيب myofibrillar المتصاعد مماثلة لتلك الخلايا العضلية ومقلص الكبار (الشكل 3).
الشكل 1 : أعلى. وتظهر صورة مجهرية الفلورية أنبوب القلب بأكمله من melanogaster ذبابة الفاكهة التي تعبر عن البالغين ، الميوسين GFP. لقد التقطت الصورة مع مجهر زايس Z1 تصوير فلوري وحدة مجهزة Apotome الانزلاق. هو المسمى هو مبين في الميوسين ، GFP الخضراء ، ملطخة أكتين مع 594 AlexaFluor phalloidin ® (الحمراء) ، وα actinin - المضادة للα - actinin الأضداد (الأزرق). علما الإجراء التحضيرية تصاريح استخراج العينات القلب مع هياكل المحفوظة جيدا. CC = المخروطية الغرفة ؛ AM العضلات alary = ؛ V = الداخلية صمام ؛ VLL = طبقة العضلات البطنية الطولية. القاع. منطقة أنبوب القلب للبالغين من خلال الجزء CC البطن 3 من القلب فقط تحت طبقة الطولي بطني يبين ترتيب myofibril المتصاعد من العضلية مقلص. الرجاء النقر هنا لنسخة أكبر من الشكل 1A ، و هنا لنسخة أكبر من الرقم 1B
الشكل 2 : مداخن مبائر الممثل للجزء الأمامي من القلب للبالغين ملطخة 594 AlexaFluor phalloidin ® (الحمراء) ، ومضاد للPericardin (الكولاجين النوع الرابع) (الأخضر) الأجسام المضادة. ويرتبط Pericardin مع القلب على طول السطح البطني ، والتي تنشأ على الأرجح من اللييفات العضلية الموجهة طوليا من طبقة العضلات البطنية. الرجاء النقر هنا لنسخة أكبر من الشكل 2.
الرقم 3 : صورة مجهرية من الفلورسنت A7 قطعة من القلب السليم ليرقة ذبابة الفاكهة مرحلة الثلاث. لقد التقطت الصورة مع مجهر زايس Z1 تصوير فلوري وحدة مجهزة Apotome الانزلاق. اتسخت يسمى الأكتين مع 594 AlexaFluor phalloidin ® (الخضراء) وα actinin - المضادة للα - actinin الأضداد (الحمراء). الرجاء النقر هنا لنسخة أكبر من الرقم 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نقدم بروتوكول مفيدة لإعداد وتلطيخ الظهرية melanogaster ذبابة الفاكهة السفن والأنسجة المرتبطة بها عن طريق التصوير المجهري أو مبائر الفلورسنت. ونحن نقدم سردا موجزا للخطوات التي المكرر واستخداما في مختبرنا للتلوين الفعالة التي تسمح جيدا حلها في الموقع من التصوير اليرقات وأنابيب الكبار القلب ذبابة الفاكهة. وقد وصفت وسائل أخرى مماثلة في شكل مختصر 2 ، 3 ، 4.
تفاصيل إضافية مهمة تتطلب النظر فيها عند تنفيذ الإجراء تلطيخ. على سبيل المثال ، وجدت كما هو الحال مع المواد البيولوجية الأخرى ، وإلى حد ما متوافقة مع ألياف عضلة القلب ذبابة الفاكهة تصبح هشة جدا بعد التثبيت. وتجدر الإشارة بوجه خاص هي متعددة أزواج من الألياف alary داعمة تعلق على أنبوب القلب ، والتي هي حساسة بشكل كبير 5 ، 6 ، 7. وهكذا ، مما يحد من التلاعب غير الضرورية يقلل من الاجهاد البدني والأضرار المباشرة للأنسجة الثابتة وأنه يزيد من احتمال تصور هياكل المحفوظة جيدا وسليما تماما. مزيد من التعامل مع عينات الكبار فقط على حواف الشديد للبشرة يقلل من احتمالات اضطراب الأنسجة.
ومن الضروري أيضا أن نلاحظ أنه ينبغي النظر في خطوات هذا البروتوكول كنقطة انطلاق لمجرد immunostaining نجاح اليرقات وقلوب الكبار ذبابة الفاكهة. يتم تقليل المنهجية إلى الحد الأدنى من عدد الخطوات اللازمة لالكواشف التي يشيع استخدامها في المختبر لدينا. كما هو الحال مع أي بروتوكول المناعية ، قد تتطلب بعض الأضداد ظروف مختلفة (حظر ، كميات متفاوتة من المنظفات ، الغسيل خطوات طويلة ، الخ). ولذلك يمكن أن يكون هذا البروتوكول تجريبيا الأمثل لمثل هذه الأجسام المضادة لتلبية الاحتياجات الفريدة للتلوين يحتمل أي بنية القلب ذبابة الفاكهة.
دراسة القلب باستخدام التقنيات الموصوفة هنا هي قوية ولا سيما منذ ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو النظام النموذجي الانقياد للغاية أن تستفيد من طائفة واسعة من أدوات متطورة الجينية. هذه الأدوات تسمح سلطة التحقيق لا مثيل لها لدراسة تطوير وبناء وظيفة عضلة القلب ومكوناته. على سبيل المثال ، ساعدت طفرة تحليل البروتينات cytoarchitectural في قلب التعرف على نماذج متنوعة من عضلة القلب في ذبابة الفاكهة 8 و 9. كشف العلامات من مكونات الفلورسنت sarcomeric من هذه النماذج التي رافقت اتساع القلب في الفوضى عن طريق الذباب myofibrillar وفقدان المواد مقلص. بالإضافة إلى ذلك ، هناك عدة خطوط GFP - الإدراج متاحة حاليا 10. ويمكن استخدام بروتوكول أعلاه بالاقتران مع مثل هذه الخطوط لجمع معلومات مفصلة عن المورفولوجية التعريب والتفاعلات الجزيئية المحتملة التي GFP الموسومة البروتينات. علاوة على ذلك ، الجينوم على نطاق مجموعات من خطوط الطيران رني جود 11 ضربة قاضية انتقائية تسمح للمكونات البروتين داخل القلب 12. بروتوكول لدينا تلوين ، تليها المجهري مناسبة ، بالاشتراك مع ضربة قاضية القلب محددة من الجينات في المصالح ، تمكن من تحليل دقيق للمساهمة في بنية البروتين وظيفة القلب. معا ، وجعل هذه التقنيات طريقة الفرز قوية للمساعدة في فك تصور وأهمية مجموعة من المعروف ، أو uncharacterized سابقا ، والمكونات اللازمة للبروتين القلب السليم مورفولوجيا وفسيولوجيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
المؤلفان بالشكر SI برنشتاين (جامعة ولاية سان دييغو) لقراءة نقدية واقتراحات مفيدة بشأن إعداد هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل عن طريق منح المعاهد الوطنية للصحة لبرنشتاين SI ، SDSU ، ور بودمر ، BIMR ؛ وزمالة في مرحلة ما بعد الدكتوراه من الدول الغربية التابعة لرابطة القلب الأميركية إلى Vogler زاي وألف Cammarato.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Reagent | Polysciences, Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 phalloidin | Reagent | Invitrogen | A12381 | |
| Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI | Reagent | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Tungsten pins | Reagent | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pin holder | Reagent | Fine Science Tools | 26018-17 |
References
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
- Dulcis, D., Levine, R. B. Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster. J Neurosci. 2, 271-280 (2005).
- Zeitouni, B. Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila. PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change. J. Morphol. 2, 351-399 (1936).
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , Wiley. New York. (1950).
- Rizki, T. M. The circulatory system and associated cells and tissues. , Academic Press. New York. (1978).
- Cammarato, A. Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).
- Taghli-Lamallem, O. Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype. Aging Cell. 2, 237-249 (2008).
- Kelso, R. J. a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).
- Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 7150, 151-156 (2007).
- Mery, A. The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function. J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).
