Summary
Här beskriver vi ett grundläggande protokoll för fluorescerande märkning av olika delar av hjärtat rör från larv och vuxen
Abstract
Den
Protocol
Innan du börjar
- Förbered följande lösningar:
- avslappnande buffert (konstgjord Drosophila hemolymph (ADH) (se "Visualisera bultande hjärta i Drosophila") som innehåller 10 mM EGTA)
- fixativ (4% formaldehyd i 1x PBS)
- PBSTx (PBS innehållande 0,1% Triton-X-100)
- Lämpligt utspädd primär och artspecifika fluorescerande sekundära antikroppar i PBSTx
- Dissekera Drosophila att exponera hjärt rör (av vuxna flugor och / eller larver) efter
- semi-intakt Drosophila hjärtat förberedelse protokollet i "Visualisera bultande hjärta i Drosophila", eller
- Drosophila Larvernas NMJ Dissection protokoll 1 med följande ändringar: Använd syresatt ADH under larver dissekering och tränga undan den bakre stiftet något från den ventrala mittlinjen. Larver skärs längs den ventrala mittlinjen. Ta inte bort någon vävnad före fixering.
Fluorescerande färgning
- Kontrollera att alla hjärtan rytmiskt slår i syresatta ADH. Snabbt ersätta ADH med avkopplande buffert. Undersök varje hjärt röret för att säkerställa sammandragningar hämmas.
- Fäst hjärtan genom att ersätta den avkopplande bufferten med fixativ. Inkubera vid rumstemperatur i 20 minuter med försiktig skakning. (För larver beredning skaka behövs inte vid något steg, och kan anses skadligt för hjärtvävnad integritet).
- Tvätta prover tre gånger i tio minuter med PBSTx vid rumstemperatur med ständig skakning.
- För vuxna, försiktigt trimma tillbaka ventrala kanterna av buken nagelbanden så att det som återstår är mer elliptisk och mindre rundade. Dessutom, med ett enda snitt mellan buken och bröstkorgen, noggrant och snyggt separata båda segmenten kropp och säkerställa minimal skada på främre delen av hjärtat. För larver hjärtan, försiktigt bort det fett kroppen med hjälp av bra pincett. Fettet avlägsnas måste utföras med stor försiktighet eftersom de larver hjärtat är särskilt ömtåliga och har mycket lite stöd från andra muskler eller bindväv. Ta inte bort luftrör grenar eftersom det kan skada hjärtat.
- Överför trimmade dorsala region i buken nagelbanden i kanterna, undvika kontakt med den centralt belägna hjärt-rör, in i en 96 bra platta med brunnar som innehåller 50-100 ìl av primär antikropp utspätt i PBSTx. Placera inte mer än 12 exemplar per brunn. Inkubera vid rumstemperatur i 2 timmar med ständig oro. Inkubationen kan också göras över natten vid 4 ° C.
- Ta bort primär antikropp lösning. Tvätta hjärtan tre gånger tio minuter med 100 l PBSTx vid rumstemperatur med ständig skakning.
- Efter borttagande av sista tvättbuffert, tillsätt 100 ìl av sekundär antikropp i PBSTx, kompletterat med Alexa594-phalloidin (1:1000). Inkubera i en timme med ständiga skakningar vid rumstemperatur. Håll prover täckas för att förhindra fluoroforen blekning.
- Efter sekundära inkubation, tvätta hjärtan tre gånger tio minuter med 100 ìl PBSTx vid rumstemperatur med ständig skakning. Håll proverna omfattas hela tvätten steg.
- För borttagning av Triton-X-100, skölj hjärtan en sista gång i 100 l av PBS i 10 minuter. Proverna kan förvaras i mörker vid 4 ° C i flera dagar innan montering.
Montering för vuxna Hearts
- Följ två 18 x 18 halk mm pärm till ett objektsglas med 10 ìl Vectashield monteringsmedel. Den täckglas ska vara placerade ~ 10-15 mm. Placera en liten tredje släppområdeskällan av monteringsmedium i-mellan de två täckglas.
- Placera 20 l Vectashield i centrum av en tredje täckglas.
- Ta försiktigt bort alla hjärtan från PBS tvättlösning av den extrema kanterna på nagelbanden, och försiktigt placera dem hjärtat nedåt på droppe monteringsmedium på tredje täckglas. Placera inte mer än fem hjärtan per droppe på täckglas.
- Kontrollera under ett mikroskop för att se alla hjärtan är vända nedåt.
- Vänd försiktigt täckglas med hjärtan och snabbt placera den på bilden innehåller par av täckglas så att droppen med hjärt rör säkringar med Vectashield droppe mellan täckglaset par. En "bro" bör bildas av täckglas. Hjärtan kommer att skjutas upp mellan ett täckglas och objektglas.
- Kontrollera i mikroskop för att se till att hjärtan nu uppåt.
- Fix täckglas på deras kanter med nagellack.
- Hjärtan är nu redo att avbildas via fluorescerande eller konfokalmikroskopi.
- Placera en droppe (~ 20 l) Vectashield på ett objektglas.
- Försiktigt överföra upp till två larver exemplar till Vectashield och orientera dem ryggsidan ner med volfram nålar.
- Individuellt dra exemplar ur monteringsmedium och anpassa varje parallellt.
- Sätt på ett täckglas på motsatta sidor av provexemplaret. Använd pincett, placera tredjedel täckglas ovanpå, först genom att lägga ena sidan på den bakre täckglaset och sänka ner det till den främre täckglas och utgör därmed en bro. Kapillärkrafter kommer att orsaka ett flöde av Vectashield från bakre till främre som hjälper korrekt anpassning av larver hjärtat.
- Fixa alla täckglas på plats på deras kanter, med nagellack och noggrant fylla utrymmet mellan täckglas med 20-30 l Vectashield.
- Tätning med nagellack och förvara vid 4 ° C, eller för långvarig förvaring vid -20 ° C.
Representativa resultat
När genomförs korrekt, bör alla komponenter och tillhörande vävnader i ryggens fartyget förblir intakt och lätt visualiseras. Bakgrunden fluorescens bör vara minimal. För vuxna, den ventrala longitudinella muskellagret fläckar mycket bra och ger en betydande signal (Figur 1 och Figur 2). Den underliggande runda cardiomyocytes tenderar dock att inte producera så intensivt en signal som den överliggande ventrala lagret. Den myocyter i främre "koniska kammare" av den vuxna hjärtat innehåller en stor mängd kontraktila material och därmed framstår denna region som den mest robusta i förhållande till resten av hjärt-röret. Den larver hjärtat visar en spiral myofibrillar arrangemang som liknar den vuxna kontraktila cardiomyocytes (Figur 3).
Figur 1: Top. En fluorescerande mikroskop visar hela hjärtat tub med en vuxen Drosophila melanogaster som uttrycker myosin-GFP. Bilden togs med en Zeiss Imager Z1 fluorescerande mikroskop utrustat med en Apotome glidande modul. Myosin-GFP visas i grönt är aktin färgas med AlexaFluor ® 594 phalloidin (röd) och α-actinin är märkt med anti-α-actinin antikropp (blå). Notera den förberedande förfarande medger indrivning av hjärtats prover med välbevarade strukturer. CC = konisk kammare, AM = alary muskler, V = intern ventil, VLL = ventral längsgående muskler lager. Botten. En region av den vuxna hjärt röret från CC genom den 3: e abdominal-segmentet i hjärtat precis under den ventrala längsgående skiktet som visar stigande myofibrill arrangemang av kontraktila cardiomyocytes. Vänligen klicka här för en större version av Figur 1a, och här för en större version av Figur 1b
Figur 2: Representant konfokala högar av en främre delen av den vuxna hjärtat färgas med AlexaFluor ® 594 phalloidin (röd) och en anti-Pericardin (kollagen typ IV) (grön) antikroppar. Pericardin förknippas med hjärtat längs ventrala yta, sannolikt härrör från longitudinellt orienterade myofibrils av den ventrala muskler lagret. Vänligen klicka här för en större version av figur 2.
Figur 3: En fluorescerande mikroskop av segment A7 i hjärtat korrekt av en etapp tre Drosophila larv. Bilden togs med en Zeiss Imager Z1 fluorescerande mikroskop utrustat med en Apotome glidande modul. Actin är märkt med AlexaFluor ® 594 phalloidin (grön) och α-actinin är färgade med anti-α-actinin antikropp (röd). Vänligen klicka här för en större version av figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll användbar för att förbereda och färgning av Drosophila melanogaster rygg fartyg och tillhörande vävnader för bildhantering via fluorescerande eller konfokalmikroskopi. Vi tillhandahåller ett kortfattat av stegen raffinerade av och ofta i vårt labb för effektiv färgning som tillåter väl löst in situ avbildning av larver och vuxna Drosophila rör hjärtat. Andra har beskrivit liknande metoder i förkortad form 2, 3, 4.
Viktiga ytterligare detaljer bör beaktas vid genomförandet av färgningsproceduren. Till exempel, som du hittar med andra biologiska material, ganska kompatibel Drosophila hjärt muskelfibrerna blivit ganska sköra efter fixering. Av särskilt intresse är de många par av stödjande alary fibrer knutna till hjärt-röret, som är betydligt känsliga 5, 6, 7. Således begränsa onödig manipulation minskar den fysiska stress och direkta skador på den fasta vävnaden och det ökar sannolikheten för att visualisera välbevarade och helt intakta strukturer. Vidare hantering av vuxna prov endast vid extrema kanterna av nagelband minimerar risken för vävnad störning.
Det är också viktigt att notera att de steg av detta protokoll skall betraktas som enbart en utgångspunkt för en lyckad immunfärgning av larver och vuxna Drosophila hjärtan. Metodiken är reducerad till det minsta antalet steg som krävs för de reagenser som ofta används i vårt laboratorium. Som med alla immunohistokemi protokoll, kan vissa antikroppar kräver olika förhållanden (blockering, varierande mängder av rengöringsmedel, långvarig tvätt steg, etc.). Detta protokoll kan därför empiriskt optimerad för sådana antikroppar för att möta de unika färgning behov av alla tänkbara Drosophila hjärt-struktur.
Studera i hjärtat med hjälp av de metoder som beskrivs här är särskilt kraftfull eftersom Drosophila melanogaster är en mycket lätthanterlig modell system som drar nytta av ett brett utbud av väl utvecklade genetiska verktyg. Dessa verktyg tillåter ojämförbar undersökande makt för att studera utveckling, struktur och funktion i hjärtmuskeln och dess komponenter. Till exempel har mutationer analys av cytoarchitectural proteiner i hjärtat hjälpte till att identifiera en mängd kardiomyopati modeller i Drosophila 8, 9. Fluorescerande märkning av sarcomeric komponenter i dessa modeller har visat att hjärt dilatation i flugor åtföljs av myofibrillar oordning och en förlust av kontraktila material. Dessutom flera GFP-isättning linjer finns för närvarande 10. Ovanstående protokoll kan användas i kombination med sådana linjer för att samla in detaljerad morfologisk information om lokalisering och potentiella molekylära interaktioner som gjorts av GFP-märkta proteiner. Dessutom genomet hela RNAi samlingar av fluglinor finns 11 som tillåter selektiv ÖVERVÄLDIGANDE av protein beståndsdelar i hjärtat 12. Vår färgningsprotokollet, följt av lämplig mikroskopi, i samband med hjärt-specifika ÖVERVÄLDIGANDE av gener av intresse, att noggrann analys av ett protein som bidrar till hjärt struktur och funktion. Tillsammans utgör dessa tekniker gör en kraftfull screening metod för att hjälpa visualisera och tolka betydelsen av en mängd kända, eller tidigare uncharacterized, protein komponenter som krävs för korrekt hjärt morfologi och fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna tackar SI Bernstein (San Diego State University) för kritisk läsning och användbara förslag om utarbetandet av detta manuskript. Detta arbete stöddes av NIH bidrag till SI Bernstein, SDSU, och R. Bodmer, BIMR och genom ett post doc stipendium från västra staterna Affiliate av American Heart Association till G. Vogler och A. Cammarato.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Reagent | Polysciences, Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 phalloidin | Reagent | Invitrogen | A12381 | |
| Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI | Reagent | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Tungsten pins | Reagent | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pin holder | Reagent | Fine Science Tools | 26018-17 |
References
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
- Dulcis, D., Levine, R. B. Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster. J Neurosci. 2, 271-280 (2005).
- Zeitouni, B. Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila. PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change. J. Morphol. 2, 351-399 (1936).
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , Wiley. New York. (1950).
- Rizki, T. M. The circulatory system and associated cells and tissues. , Academic Press. New York. (1978).
- Cammarato, A. Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).
- Taghli-Lamallem, O. Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype. Aging Cell. 2, 237-249 (2008).
- Kelso, R. J. a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).
- Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 7150, 151-156 (2007).
- Mery, A. The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function. J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).
